1、由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，MHP)和胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)單獨感染或混合感染是引起目前呼吸道綜合癥的主要原因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的危害。豬傳染性胸膜肺炎弱毒疫苗是一種新型疫苗，優(yōu)于傳統(tǒng)的滅活疫苗，它可以激發(fā)良好的體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫，具有良好的抗體反應和不同血清型菌感染的交叉保護，而且使用方便、成本低，是當前國內(nèi)外研究的熱點

2、。 針對臨床中這兩種病原同時感染或繼發(fā)感染的現(xiàn)狀，而分別接種單獨的疫苗會造成豬只的應激和養(yǎng)殖成本增加，以致弱的胸膜肺炎放線桿菌表達MHP主要抗原蛋白的突變株，并研制有效的基因工程疫苗，是預防這兩種呼吸道傳染病的策略。 本研究以APP血清10型菌株和豬肺炎支原體為材料，分別克隆APP毒素apxI操縱子的調節(jié)基因apxIC以及MHP主要免疫原性蛋白——乳酸脫氫酶(P36)基因，將P36基因插入到apxIC，構建含抗生素標記和

3、負向篩選標記的中間轉移載體pEICALDH。將pEICALDH熱激法轉化大腸桿菌X7213感受態(tài)細胞，將轉化的陽性子再與胸膜肺炎10型菌進行接合轉移試驗，通過同源重組，在DAP缺乏的含NAD的TSA培養(yǎng)基上，利用營養(yǎng)缺陷篩選法和SacB負向篩選法，獲得P36基因插入apxIC基因的APP突變株，該突變株不含抗生素抗性基因，用突變株培養(yǎng)上清，濃縮后進行westernbolt檢測，發(fā)現(xiàn)濃縮蛋白能與毒素I單抗反應。將該毒株劃線接種于含綿羊紅細

4、胞和NAD的TSA培養(yǎng)基上，觀察24-72個小時，未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象，說明該突變株喪失了親本菌株所具有的溶血活性。將107CFU/ml的突變株和親本菌分別接種10只Balb/C小鼠，連續(xù)觀察14天，親本菌在接種后24小時內(nèi)小鼠全部死亡，而突變株接種組小鼠死亡3只，TSB接種組小鼠全部存活，說明突變株對小鼠的毒力下降；用2×106CFU/ml重組菌免疫Balb/C小鼠，一個月后用2×108CFU/ml親本菌攻擊免疫鼠，保護率為100％，而TS

5、B對照組小鼠全部死亡。這些結果說明，該突變株有望用于疫苗研究。 環(huán)介導的基因擴增技術(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種新型的恒溫核酸擴增方法，具有特異、高效、快速的特征。利用水浴鍋以及基于apxIV基因設計的6個特異性引物，LAMP可以在30分鐘內(nèi)快速檢測胸膜肺炎放線桿菌。通過加入SYBRGreenI染料，擴增產(chǎn)物可以肉眼觀察。LAMP法檢測胸膜肺炎放線桿菌的特異性與Ne