1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)的病原體，能引起豬的一種高度接觸性呼吸道傳染病，是集約化豬場常見的豬病之一，死亡率高，對世界各地的養(yǎng)豬業(yè)均造成巨大經(jīng)濟損失。胸膜肺炎放線桿菌血清型眾多，商品化的滅活疫苗和亞單位疫苗缺乏完全的交叉免疫保護力。為預(yù)防和控制這一疾病的發(fā)生和流行，對于安全、有

2、效的新型疫苗的研發(fā)迫在眉睫。近年來各國都在積極研究基因缺失弱毒苗對豬傳染性胸膜肺炎的保護效果，初步的動物實驗結(jié)果已經(jīng)表明弱毒苗可抵抗多種血清型菌株的攻擊，交叉免疫保護力比傳統(tǒng)疫苗更強，有望取代目前的滅活苗。但是，通過基因缺失的APP弱毒疫苗對外界抵抗力弱，菌株凍干保藏過程中容易死亡，影響弱毒疫苗的免疫效果和推廣使用。鑒于此背景，本課題主要研究APP弱毒苗凍干保護劑，以提高APP的凍干存活率。本研究的主要內(nèi)容包括以下幾個方面：
　　

3、1．基因缺失疫苗菌種的確定
　　通過 PCR方法鑒定菌種正確。然后對基因缺失 APP弱毒菌株生長特性進行研究，結(jié)果表明，其生長條件為37℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時要加入10％的血清和終濃度為10μg/mL的NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide)。通過測定生長曲線得出菌株最佳收菌時間為接種后5-7h。
　　2．基礎(chǔ)保護劑篩選
　　參考文獻，配制了10種保護劑配方，對APP進行凍干預(yù)實驗，成功

4、確定3種具有良好保護效果的保護劑成分，分別為脫脂牛奶、海藻糖和甘油。
　　3．探究菌液、保護劑濃度比對凍干的影響
　　在脫脂牛奶、海藻糖和甘油3種成分的基礎(chǔ)上進行保護劑配方的配制，并進行了菌液、保護劑濃度比的探究。分別設(shè)置菌液：保護劑=1:1、菌液：保護劑=1:2和菌液：保護劑=2:1的濃度比進行凍存實驗和凍干實驗。結(jié)果表明，菌液：保護劑=1:2的配方對樣品菌株的保護效果最好，其中配方10%脫脂牛奶+4%海藻糖+2%甘油的保

5、護效果最為顯著，凍干率為36.7%。
　　4．正交實驗篩選最優(yōu)基礎(chǔ)保護劑
　　在配方10%脫脂牛奶+4%海藻糖+2%甘油的基礎(chǔ)上通過正交實驗設(shè)計了9種保護劑配方，最終篩選出了最優(yōu)基礎(chǔ)保護劑配方為：9.5%脫脂牛奶+3.5%海藻糖+2.0%甘油，凍干率為38.0%。
　　5．添加優(yōu)化因子優(yōu)化保護劑配方
　　通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)幾種在其他菌株凍存具有良好保護效果的保護因子，分別為牛血清白蛋白、蔗糖、D-山梨醇、L-精氨

6、酸、甘氨酸、NAD，通過凍存和凍干實驗，結(jié)果表明這些優(yōu)化因子對APP的保護效果并不顯著，有的甚至產(chǎn)生明顯的負效應(yīng)，這說明保護劑成分具有一定的菌種特異性，并不是所有的保護劑對APP弱毒菌株都具有良好的凍干保護效果，應(yīng)該根據(jù)情況適量添加。
　　6．重復(fù)驗證試驗
　　為了保證凍干保護劑效果的穩(wěn)定性，對上述試驗中具有較好保護效果的3種配方又進行了一次重復(fù)試驗，結(jié)果顯示保護劑配方9.5%脫脂牛奶+3.0%海藻糖+3.0%甘油凍干保護效

7、果最好，凍干存活率達到72.07%。接著用此配方又進行了兩次凍干驗證試驗，綜合這三次凍干驗證試驗 APP弱毒苗的凍干存活率維持在65%-75%之間，平均凍干存活率為69.16%。
　　7．疫苗凍干保存期試驗
　　將APP凍干菌粉置于－20℃保存，之后每隔一個月隨機取出兩瓶進行活菌計數(shù)并計算凍干存活率。目前已計數(shù)到4個月的凍干存活率(平均凍干存活率為66.48%)，活菌數(shù)仍然維持在108CFU/ml，表明本研究中使用的凍干保護