豬瘟強毒株與兔化弱毒疫苗株的環(huán)介導等溫擴增鑒別檢測.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、豬瘟(classicalswinefever,CSF)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一種重大傳染病,具有很高的死亡率,對我國生豬產業(yè)造成巨大的損害。CSFV是單股正鏈RNA病毒,基因組大小約為12.3kb,編碼一個大的多聚體蛋白,蛋白酶將其裂解成12種蛋白,包括8種非結構蛋白(P7、Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B和4種結構蛋白(囊膜糖蛋

2、白Erns、衣殼蛋白C、E1、E2),其中,5'-UTR、3'-UTR、NS5B基因序列比較保守,而NS5B常用于CSFV基因分型。目前,我國豬瘟的防控主要采用豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)免疫,但是由于缺乏相應的血清學標志和配套的鑒別檢測方法,其在我國的大規(guī)模應用,使得通過抗體檢測很難區(qū)分免疫弱毒和野毒感染,不利于豬瘟的凈化。
  針對豬瘟病毒野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷的關鍵問題,本研究參照GenBank中登錄的CSFV標準強毒株

3、(shimen、Alfort、Brescia等)、疫苗株(HCLV、ChineseC、Rimes等)、不同基因亞型的CSFV野毒株以及牛病毒性腹瀉病毒1型(BVDV-1)和牛病毒性腹瀉病毒2型(BVDV-2)的全基因組序列,利用DNAstar軟件系統(tǒng)比較分析豬瘟強弱毒株的序列差異,設計一套分別針對豬瘟弱毒與強毒的特異性環(huán)介導等溫擴增(LAMP)引物,優(yōu)化LAMP反應體系與反應條件,分別建立CSFV強毒株和弱毒疫苗株的LAMP檢測方法。結

4、果表明65℃恒溫作用50min即可完成LAMP擴增,LAMP擴增產物用羅丹明B指示劑肉眼觀察顏色變化,陽性呈黃色,陰性呈橙紅色;用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,陽性擴增有特異性梯形條帶產生。經檢測,豬瘟強毒株的特異性LAMP檢測方法對豬瘟弱毒疫苗及其他豬源病毒均無特異性擴增,豬瘟弱毒疫苗株的LAMP檢測方法亦如此,特異性良好,同時建立的LAMP檢測方法比RT-PCR靈敏度高出1000倍,且重復性穩(wěn)定性良好。用建立的LAMP方法和RT-PCR方

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