1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是引起豬流行性腹瀉(PED)的病原，也是豬重要的腸道病原之一;本病以引起豬的急性水樣腹瀉、嘔吐和迅速脫水為主要特征，5日齡內(nèi)的仔豬感染后死亡率可達(dá)100％。因此，我國(guó)大部分豬場(chǎng)都會(huì)用疫苗來(lái)預(yù)防PED。但是，從2010年以來(lái)，PED突然在我國(guó)南方地區(qū)暴發(fā)并迅速傳播到全國(guó)各地，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而疫苗在這次的PED流行中并沒(méi)有給豬群應(yīng)有的保護(hù)。
　　 為了揭示豬場(chǎng)PED弱毒疫苗免疫失敗的

2、原因，本試驗(yàn)從廣東、廣西和湖北的3個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)得到了3株P(guān)ED弱毒活疫苗，首先對(duì)3株疫苗毒株進(jìn)行M基因的測(cè)序，結(jié)果顯示3株疫苗毒株有兩個(gè)疫苗毒株的序列完全一樣，另一個(gè)毒株有1個(gè)核苷酸的突變，說(shuō)明3株疫苗毒株來(lái)源相同。我們選取其中一株疫苗毒株，進(jìn)行基因組全序列測(cè)定，并分析疫苗毒株與流行毒株的全序列、S、M、N、ORF3的核苷酸和氨基酸的序列差異，從基因水平上分析豬場(chǎng)免疫失敗的原因。
　　 遺傳進(jìn)化結(jié)果顯示，無(wú)論在全基因組水平還是在

3、各個(gè)基因水平，疫苗毒株與目前流行毒株的親緣關(guān)系都很遠(yuǎn)。在全基因組水平，疫苗毒株與目前流行毒株的同源性為97.1％～97.2％;在三個(gè)結(jié)構(gòu)基因S、M、N的水平上疫苗毒株與目前流行毒株的核苷酸（氨基酸）同源性分別為93.7％～95％（92％～93.4％）、97％～98.7％(97.3％～98.6％)、95.7％～97.3％(95.9％～97.5％)。由此可以看出疫苗毒株與流行毒株的核苷酸同源性很低，從一個(gè)方面說(shuō)明弱毒疫苗不能很好的保護(hù)仔豬免

4、受流行毒株的感染。分析疫苗毒株和流行毒株的主要免疫原性基因發(fā)現(xiàn)，在S基因預(yù)測(cè)的受體結(jié)合位點(diǎn)和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵區(qū)域，疫苗毒株和流行毒株都有氨基酸的突變，在M基因和N基因內(nèi)部，流行毒株相對(duì)于疫苗毒株也有很多氨基酸位點(diǎn)的突變，預(yù)測(cè)這些位點(diǎn)的突變可能造成了流行毒株毒力的增強(qiáng)或者造成PEDV抗原性發(fā)生變化，從而造成了PEDV弱毒疫苗對(duì)PED流行毒株免疫失敗。
　　 通過(guò)PEDVM基因和N基因的進(jìn)化樹(shù)、核苷酸和氨基酸的序列比較發(fā)現(xiàn)

5、，以中國(guó)2004年的毒株JS-2004-2為代表的PEDV毒株與近兩年流行的PEDV變異毒株在進(jìn)化關(guān)系和同源性方面都很接近，說(shuō)明他們之間的親緣關(guān)系很近，由此可以推測(cè)PEDV的變異毒株可能很早就在我國(guó)的豬場(chǎng)存在。我國(guó)目前的流行的PED變異毒株很有可能就是由這些毒株進(jìn)化來(lái)的。推測(cè)在2010年之前，這些毒株可能只是在很小的區(qū)域存在，加上PEDV引起的臨床癥狀和病理變化與TGEV很相似，這些變異毒株被忽略了，隨著地區(qū)間豬場(chǎng)的交流增多，變異毒株在

6、全國(guó)傳播，才造成2010年以來(lái)的PED在我國(guó)暴發(fā)。
　　 感染性克隆是研究RNA病毒致病機(jī)理的理想工具，用于感染性克隆的病毒，最好是適應(yīng)細(xì)胞的病毒。本實(shí)驗(yàn)以PEDV弱毒疫苗毒株為基礎(chǔ)，構(gòu)建了覆蓋PEDV基因組全長(zhǎng)的重組質(zhì)粒，以及用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的5’端（含CMV啟動(dòng)子）和3’端（含polyA+HDV核酶+BGH+polyadenylation序列）以及體外轉(zhuǎn)錄所需要的5’端（含T7啟動(dòng)子）和3’端(含polyA)，為PEDV感染性克