1、心力衰竭是各種心臟病的嚴(yán)重階段，發(fā)病率和死亡率高，5年存活率和惡性腫瘤相仿。心力衰竭的治療日益受到人們的關(guān)注。雖然藥物治療心力衰竭取得一定進(jìn)展，但療效有限，其它如心臟移植等外科治療存在高風(fēng)險(xiǎn)，費(fèi)用昂貴等缺陷，因此亟需尋找更為安全有效的治療方法。在心力衰竭的治療策略中，增加心肌細(xì)胞數(shù)目和糾正心肌細(xì)胞功能是治療的兩個(gè)主要方面。本研究以骨髓干細(xì)胞為平臺(tái)，腺病毒為治療基因載體，聯(lián)合鈣離子ATP酶基因(sarcoplasmicreticulumC

2、a2+-ATPase，SERCa2a)和細(xì)胞移植治療慢性充血性心力衰竭。比較單純SERCA2a基因治療，骨髓干細(xì)胞移植以及聯(lián)合基因和細(xì)胞移植治療心力衰竭的作用，探討SERCA2a基因治療，骨髓干細(xì)胞移植治療心力衰竭的可能機(jī)制，評(píng)價(jià)以SERCA2a作為基因治療靶點(diǎn)和骨髓干細(xì)胞作為平臺(tái)應(yīng)用于心力衰竭治療的可行性。為尋找慢性心力衰竭尤其終末期心力衰竭的高效安全的治療策略提供思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究分四個(gè)部分進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)第一部分觀察腺病毒

3、載體轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞(msenchymalstemcells，MSCs)的有效性和外源性基因表達(dá)的時(shí)相。體外培養(yǎng)大鼠(SpragueDawley,SD)骨髓干細(xì)胞，用已構(gòu)建好的Ad5-CMV-GFP真核載體分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的第3代(P3)及第8代(P8)MSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后第2，4，7及10天綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)率。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western雜交等方法檢測(cè)腺病毒受體(CAR)在各代MSCs中的基因和

4、蛋白質(zhì)的表達(dá)。重組腺病毒對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染率可達(dá)80％，P3與P8代MSCs轉(zhuǎn)染率無明顯差異(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染后2天可見GFP表達(dá)，第7天表達(dá)水平達(dá)高峰，28天仍可見GFP在MSCs中表達(dá)。CAR在P1明顯低于P2，P3，P6，P8各代MSCs(P＜0.05)，但P3，P6與P8MSCs表達(dá)的CAR無顯著差別(P＞0.05)。重組腺病毒載體能有效轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞，并維持1個(gè)月左右。P3與P8MSCs均可作為基因治療的高效細(xì)胞載體。

5、 實(shí)驗(yàn)第二部分以腺病毒(Ad-CMV)介導(dǎo)SERCa2a基因轉(zhuǎn)染MSCs，測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物，為心力衰竭的細(xì)胞移植和基因治療提供細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。體外培養(yǎng)大鼠骨髓干細(xì)胞，用已構(gòu)建好的Ad5-CMV-SERCa2a真核載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR、Western雜交等方法檢測(cè)SERCa2amRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。Ad5-CMV-SERCa2a對(duì)MSCs的轉(zhuǎn)染率為80％左右，沒有明顯的細(xì)胞毒性反應(yīng)。RT-PCR檢測(cè)到

6、SERCa2a，Western雜交確定SERCa2a蛋白表達(dá)。腺病毒載體可有效地介導(dǎo)SERCa2a基因轉(zhuǎn)染MSCs，并表達(dá)SERCa2a蛋白，為下一階段聯(lián)合細(xì)胞移植和基因治療心力衰竭的研究奠定細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)第三部分比較SERCA2a基因治療，MSCs移植以及聯(lián)合基因治療和細(xì)胞移植治療慢性缺血性心力衰竭的治療效應(yīng)，評(píng)價(jià)MSCs作為治療基因轉(zhuǎn)移載體的效率，探討可能的作用機(jī)制。制作心力衰竭大鼠模型并隨機(jī)分為4組。SERCA

7、2a基因治療組(組Ⅰ，n=7)，MSCs細(xì)胞移植組(組Ⅱ，n=7)，聯(lián)合細(xì)胞移植和基因治療組(組Ⅲ，n=8)，腺病毒空載體組(組Ⅳ，n=7)。檢測(cè)各組SERCA2a基因，蛋白表達(dá)及活性。超聲心動(dòng)圖及有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)心臟功能。HE染色觀察心室形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組Ⅳ相比，組Ⅰ(Ad-SERCa2a)，組Ⅱ(MSCs)，組Ⅲ(MSCs.Ad/SERCa2a)心功能和血流動(dòng)力學(xué)明顯改善。治療后組Ⅱ和組Ⅲ大鼠梗死區(qū)面積縮小，室壁厚度增加，

8、心室腔減小。細(xì)胞移植組梗死區(qū)血管密度明顯高于非細(xì)胞移植。EF14D在組Ⅰ，組Ⅱ與組Ⅲ各組中較治療前分別升高65％，49％和61％，F(xiàn)S14D較治療前分別升高65％，48％和56％(P＜0.05)。EF21D組Ⅰ，組Ⅱ與組Ⅲ較治療前分別升高48％，51％和63％，F(xiàn)S21D較治療前分別升高48％，51％和59％(P＜0.05)。組Ⅳ(Ad)14D心功能無變化，21D心功能顯著下降。組ⅣEF21D及FS21D均較治療前下降18％(P＜0.0

9、1)。21D血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，組Ⅰ，組Ⅱ，組Ⅲdp/dtmax絕對(duì)值均高于對(duì)照組組Ⅳ(6026.31±280.89mmHg/s，6278.29±318.81mmHg/s，7056.59±388.99mmHg/s，5521.90±267.85mmHg/s，P＞0.01)。組Ⅰ和組ⅢSERCA2a基因，蛋白及酶活性均高于組Ⅱ和組Ⅳ(P＜0.01)。 該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單純SERCA2a基因治療，MSCs移植和聯(lián)合治療均能顯著改善慢性缺

10、血性心力衰竭大鼠心功能和血流動(dòng)力學(xué)。MSCs移植和聯(lián)合治療組大鼠室壁厚度增加，室腔形態(tài)改善。MSCs移植和聯(lián)合治療組大鼠心臟呈現(xiàn)穩(wěn)定持續(xù)的心功能改善作用。而聯(lián)合治療組比單純MSCs移植組大鼠顯示隨時(shí)間更為增強(qiáng)的治療效應(yīng)趨勢(shì)。MSCs可以作為治療基因的有效轉(zhuǎn)移載體。SERCA2a基因治療在治療早期表現(xiàn)出最強(qiáng)的心功能增強(qiáng)幅度，但21天后，改善幅度開始下降，可能與所用腺病毒載體有關(guān)。在單純SERCA2a基因治療中，SERCA2a表達(dá)活性蛋白，

11、糾正異常的鈣離子穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)了心功能。而在聯(lián)合治療中呈現(xiàn)比單純細(xì)胞移植隨時(shí)間更為增強(qiáng)的治療效應(yīng)可能與SERCA2a保護(hù)移植細(xì)胞防止細(xì)胞凋亡有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)第四部分包括兩個(gè)實(shí)驗(yàn)探討了骨髓干細(xì)胞移植治療慢性心力衰竭的機(jī)制。 第四部分實(shí)驗(yàn)一觀察骨髓干細(xì)胞移植后對(duì)左室重構(gòu)及梗死后瘢痕區(qū)的影響和可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)扎雌性SD大鼠左冠狀動(dòng)脈制作急性心肌梗死模型。4周后隨機(jī)分為移植組(n=7)和對(duì)照組(n=7)。將雄性SD大鼠來源的骨髓干細(xì)胞

12、(5×106)移植到梗死后瘢痕區(qū)。通過HE染色和Masson染色評(píng)價(jià)左室形態(tài)。免疫組織化學(xué)分析瘢痕區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原，心肌MMP2和TIMP1表達(dá)情況。Western雜交檢測(cè)MMP2和TIMP1蛋白變化。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，移植組大鼠收縮和舒張功能增強(qiáng)。MSCs在移植后21天呈長梭形。移植后早期有炎癥細(xì)胞聚集在瘢痕區(qū)，移植后7天炎癥細(xì)胞減少，21天可在瘢痕區(qū)觀察到大量微血管形成。左室厚度率增加(76.34±2.66％，64.37±2.36

13、％，P＜0.05)，梗死區(qū)面積縮小(36.19土0.83％，42.12±1.88％，P＜0.05)。移植組大鼠瘢痕區(qū)Ⅰ型膠原表達(dá)升高，Ⅲ型膠原降低；心肌MMP2蛋白水平降低而TIMP1水平升高。結(jié)果表明MSCs移植通過MMP2/TIMP1導(dǎo)致瘢痕區(qū)膠原網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化，膠原重建，室壁彈性和僵硬度達(dá)到有利于心臟力學(xué)的新平衡，從而改善慢性缺血性心力衰竭心臟左室重構(gòu)。 第四部分實(shí)驗(yàn)二研究了MSCs移植對(duì)慢性心力衰竭瘢痕周邊及遠(yuǎn)隔區(qū)心肌的

14、影響。制作急性心肌梗死SD大鼠。4周后隨機(jī)分為移植組(n=7)和對(duì)照組(n=7)。將雄性SD大鼠來源的骨髓干細(xì)胞(5×106)移植到梗死后瘢痕區(qū)。所有大鼠經(jīng)超聲心動(dòng)圖和組織多普勒(Dopplertissueimaging，DTI)評(píng)價(jià)心臟功能和室壁運(yùn)動(dòng)。TUNEL染色檢測(cè)檢測(cè)瘢痕組織邊緣及遠(yuǎn)隔區(qū)心肌細(xì)胞凋亡情況。HE染色和免疫組化檢測(cè)心室形態(tài)和Ⅷ、Bax、Bcl2表達(dá)情況。RT-PCR及Western雜交檢測(cè)Bax，Bcl2基因和蛋白表

15、達(dá)。 該部分結(jié)果表明冠脈結(jié)扎4周后左室前壁，左室后壁，前室間隔和二尖瓣收縮期和舒張期速度均降低。左室前壁收縮期心內(nèi)膜和心肌中層運(yùn)動(dòng)速度均明顯下降，舒張期最大平均心肌運(yùn)動(dòng)速度在心臟各層均有所下降。與對(duì)照組相比，治療后21天移植組心肌收縮及舒張期縱向峰值速度在左室前壁，后壁，前室間隔及二尖瓣水平均顯著升高。對(duì)照組和移植組左室前壁、后壁心肌，前室間隔及二尖瓣收縮期縱向峰值速度分別為(0.31±0.02cm/s，0.40±0.01cm/

16、s，0.40±0.01cm/s，0.71±0.02cm/s；0.67±0.02cm/s，2.06±0.15cm/s，1.00±0.08cm/s，2.30±0.14cm/s，P＜0.001)。對(duì)照組和移植組左室前壁、后壁心肌，前室間隔及二尖瓣舒張期縱向峰值速度分別為(0.40±0.01cm/s，0.5±0.01cm/s，0.44±0.03cm/s，0.49士0.03cm/s；1.26±0.04cm/s，2.23±0.03cm/s，1.28

17、±0.05cm/s，2.24士0.04cm/s，P＜0.001)。病理切片顯示細(xì)胞移植組大鼠瘢痕周邊缺血心肌區(qū)域比對(duì)照組大鼠瘢痕周邊缺血心肌區(qū)域縮小。與對(duì)照組大鼠相比，移植組大鼠心肌凋亡細(xì)胞減少(9.22±1.1個(gè)/mm2，28.45±3.6個(gè)/mm2，P＜0.001)，移植組瘢痕邊緣區(qū)細(xì)胞核密度增加(440.1±136.7，177.75±40.4，P＜0.001)。移植組瘢痕遠(yuǎn)隔區(qū)細(xì)胞大小比對(duì)照組細(xì)胞減小(29.49±1.59um2，

18、78.49士3.87um2，P＜0.001)。在瘢痕區(qū)，MSCs移植組可觀察到大量血管形成，部分Hochest3334標(biāo)記的核藍(lán)染細(xì)胞表達(dá)Ⅷ陽性。與對(duì)照組相比，移植組大鼠心臟Bax基因降低，Bcl2基因表達(dá)升高。Western雜交檢測(cè)Bax，bcl2蛋白表達(dá)的結(jié)果與之相符。 研究表明MSCs移植不僅促使瘢痕區(qū)血管新生，改善瘢痕邊緣缺血心肌血供，挽救缺血心肌功能，而且保護(hù)心肌細(xì)胞拮抗細(xì)胞凋亡，防止遠(yuǎn)隔區(qū)細(xì)胞肥大，逆轉(zhuǎn)遠(yuǎn)隔區(qū)心肌應(yīng)力