1、脊髓損傷是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)疾病，發(fā)病率極高。結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)是脊髓損傷后治療的關(guān)鍵。一方面由于脊髓損傷后的再生能力極其有限，另一方面對(duì)脊髓再生的調(diào)控缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，脊髓損傷的治療成為多年來(lái)困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題。 SCI后所引發(fā)的一系列原發(fā)和繼發(fā)性損傷的細(xì)胞學(xué)及分子學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重后果。長(zhǎng)期以來(lái)，人們不斷探索脊髓損傷后神經(jīng)功能永久喪失的復(fù)雜機(jī)理及相應(yīng)治療方法，并取得了令人振奮的成果。阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以最大

2、限度地減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)幸存細(xì)胞，改善神經(jīng)功能，從而達(dá)到有效的治療措施。 近年來(lái)，銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)的神經(jīng)保護(hù)作用越來(lái)越受到重視。研究表明，GB可能具有類(lèi)似生長(zhǎng)因子的作用，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的自然生長(zhǎng)，并且在許多病理情況下還能減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡，發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。本課題用E14-17天的胚胎大鼠脊髓進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)顯微測(cè)量、免疫組化染色方法研究了銀杏內(nèi)酯B對(duì)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)元以及星形

3、膠質(zhì)細(xì)胞、膽堿能神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的影響。海人藻酸(kainic acid，KA)是興奮性毒素的一種，被經(jīng)常在體內(nèi)體外試驗(yàn)中用來(lái)探索興奮性氨基酸引起細(xì)胞死亡的機(jī)制。因此，本工作以KA造成體外脊髓神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，用免疫組化、熒光染色等方法觀察GB在其中的保護(hù)作用并初步探討其保護(hù)作用的機(jī)制，為臨床應(yīng)用GB有效治療脊髓損傷提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 一．GB和NGF促進(jìn)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的研究

4、 1.正常體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育情況 用E14-1 7天的胚胎Wistar大鼠脊髓神經(jīng)組織制成的單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板后，在倒置相差顯微鏡下觀察活細(xì)胞胞體呈圓形，無(wú)突起。在培養(yǎng)12～24h后觀察可見(jiàn)大部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)變得扁平，胞體呈橢圓形，周?chē)霈F(xiàn)光暈，并伸出突起。培養(yǎng)3天時(shí)對(duì)照組平均神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量為58.5+5.30個(gè)/視野，培養(yǎng)7天和10天后，分別降至31.50±2.02和20.00+1.97?；?/p>

5、細(xì)胞顯微測(cè)量顯示：培養(yǎng)3天和7天時(shí)胞體平均直徑分別為8.18+0.821μm和11.62±1.031μm，平均每細(xì)胞的突起數(shù)分別為1.42±0.11和1.78+0.15，最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為16.28±1.071μm和83.62±9.73μm。培養(yǎng)第七天，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞行NSE免疫組化染色結(jié)果顯示：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為28.00+1.75個(gè)/視野，胞體平均面積為182.78±27.23，平均每細(xì)胞的突起數(shù)為1.68±0.32個(gè)，最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度為72.

6、53±7.92μm。GFAP免疫組化染色結(jié)果顯示：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為7.05±0.82個(gè)/視野，胞體平均面積為860.86±97.62，平均每細(xì)胞的突起數(shù)為2.95±0.76個(gè)。AChE組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為110.50±10.80個(gè)/cm<'2>，胞體平均面積為200.25±18.54，平均每細(xì)胞的突起數(shù)為1.95±0.14個(gè)，最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度為88.59±7.95μm。 2．NGF促進(jìn)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)

7、育 NGF是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，也是迄今為止研究得最清楚的一個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)液同時(shí)加入NGF(50 μg/L)，用以作為陽(yáng)性對(duì)照組。通過(guò)顯微測(cè)量、NSE、GFAP免疫組織化學(xué)染色及AChE酶組織化學(xué)染色的方法，觀察NGF對(duì)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞、NSE陽(yáng)性神經(jīng)元、GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞及AChE陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的影響。 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞相比，NGF

8、組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多，分布均勻，神經(jīng)細(xì)胞胞體大而飽滿，有光暈，呈圓形，突起較長(zhǎng)。培養(yǎng)3天、7天和10天，NGF組平均神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量分別為69.00±6.14、39.00±2.34和29.00±2.03，較對(duì)照組數(shù)量均顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)?；罴?xì)胞顯微測(cè)量顯示：培養(yǎng)3天和7天時(shí)胞體平均直徑分別為10.28±1.01μm和15.58±1.28μm，較對(duì)照組顯著增多(P<0.05，P<0.05)。平均每細(xì)胞的突起數(shù)分

9、別為2.31±0.2l和3.12±0.28個(gè)，較對(duì)照組非常顯著增多(P<0.01，P<0.01)。最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為21.95±2.01μm和102.59±10.03μm，較對(duì)照組顯著增多(P<0.05，P<0.05)。 NGF組NSE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為36.00±2.18個(gè)/視野、223.254±33.54、2.31±0.35個(gè)/細(xì)胞和89.754±8.24μm，較對(duì)照組顯

10、著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05)。GFAP陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)、胞體平均面積和平均每細(xì)胞突起數(shù)量分別為9.05±0.95個(gè)/視野、1012.364±130.19和3.954±0.82個(gè)/細(xì)胞，較對(duì)照組顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)。AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為214.00±20.10個(gè)/cm<'2>、400.844±39.46、5.15±0

11、.45個(gè)/細(xì)胞和124.23±11.59μm，較對(duì)照組顯著增多(P<0.05)。 結(jié)果提示：NGF能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的存活，促進(jìn)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及膽堿能神經(jīng)元的成熟及分化，促進(jìn)其細(xì)胞胞體及突起的生長(zhǎng)。 3.GB促進(jìn)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育 近年來(lái)的研究表明，GB可能具有類(lèi)似生長(zhǎng)因子的作用，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的自然生長(zhǎng)，但是，以上研究大多在皮層、海馬、紋狀體等處進(jìn)行，對(duì)于

12、GB在脊髓中作用中的研究較少。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)液同時(shí)加入GB(40μg/L)，通過(guò)顯微測(cè)量、NSE、GFAP免疫組織化學(xué)染色及AChE酶組織化學(xué)染色的方法，觀察GB對(duì)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞、NSE陽(yáng)性神經(jīng)元、GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞及AChE陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的影響。 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，GB處理組細(xì)胞密度較對(duì)照組大，胞體增大，呈梭形、圓形或多角形，突起較長(zhǎng)且粗。培養(yǎng)3天時(shí)GB組平均神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量為68.50±5.96個(gè)

13、/視野，培養(yǎng)7天和10天后，分別為38.50±2.26和28.00±2.15，較對(duì)照組數(shù)量均顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)?；罴?xì)胞顯微測(cè)量顯示：培養(yǎng)3天和7天時(shí)胞體平均直徑分別為10.05±1.04μm和15.26±1.03μm，較對(duì)照組顯著增多(P<0.05，P<0.05)。平均每細(xì)胞的突起數(shù)分別為2.48±0.23和3.26±0.31個(gè)，較對(duì)照組非常顯著增多(P<0.01，P<0.01)。最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為22

14、.68±2.11μm和148.724±13.99μm，較對(duì)照組顯著增多(P<0.05，P<0.01)；其中，培養(yǎng)第7天GB組神經(jīng)細(xì)胞最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度較NGF組亦顯著增多(P<0.05)。 GB組NSE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為35.50±2.05個(gè)/視野、201.16±32.42、2.56±0.43個(gè)/細(xì)胞和138.96±14.20μm，較對(duì)照組顯著增多(P<0.05，P<0.05

15、，P<0.01，P<0.01)，其中，GB組最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度較NGF組亦顯著增多(P<0.05)。GFAP陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)、胞體平均面積和平均每細(xì)胞突起數(shù)量分別為9.45±1.03個(gè)/視野、994.76±112.34和4.05±0.91個(gè)/細(xì)胞，較對(duì)照組顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)。AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為210.00±19.61個(gè)/cm<'2>、300.15±32

16、.59、5.95±0.61個(gè)/細(xì)胞和164.54±15.741．Tm，較對(duì)照組顯著增多(P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.01)。其中，GB組最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度較NGF組亦顯著增多(P<0.05)。 結(jié)果提示：GB能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的存活，促進(jìn)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及膽堿能神經(jīng)元的成熟及分化，促進(jìn)其細(xì)胞及突起的生長(zhǎng)。其促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞、NSE、GFAP、AChE陽(yáng)性細(xì)胞的存活、胞體及突起發(fā)育的作用與NGF

17、一致，而其促進(jìn)神經(jīng)突起分化與生長(zhǎng)的作用強(qiáng)于NGF。 二．GB和MK-801保護(hù)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞免受KA細(xì)胞毒性作用的研究 1．KA對(duì)體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用 KA是興奮性神經(jīng)毒素的一種，被經(jīng)常在體內(nèi)體外試驗(yàn)中用來(lái)探索興奮性氨基酸引起細(xì)胞死亡的機(jī)制。因此，本工作以KA造成體外脊髓神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，用顯微測(cè)量、免疫組化、熒光染色等方法觀察KA的細(xì)胞毒性作用并初步探討其毒性作用的機(jī)制

18、。 培養(yǎng)第五天加入損傷性藥物KA(100μM)，24小時(shí)后鏡下觀察，細(xì)胞貼壁不良，輪廓界線不清，折光性差，部分細(xì)胞胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡，突起斷裂呈串珠樣，部分細(xì)胞突起消失。損傷組存活細(xì)胞數(shù)為19.95±1.46個(gè)/視野，與對(duì)照組組相比非常顯著減少(P<0.01)。胞體平均直徑為9.57±1.24μm，平均每細(xì)胞突起數(shù)量為0.85±0.12，平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度為20.05±1.54μm，均顯著小于對(duì)照組(P<0.01，P<0.01，P<0

19、.01)。± KA損傷組NSE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為13.85±1.04/視野，104.52±14.24，0.91±0.14個(gè)/細(xì)胞和20.12±1.56μm，與對(duì)照組相比均非常顯著性減少(P<0.01)。GFAP星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)、胞體平均面積和平均每細(xì)胞突起數(shù)量分別為2.50±0.38/視野、582.96±55.37和0.92±0.13個(gè)/細(xì)胞，均非常顯著小于對(duì)照組(P<0.01)。

20、加入損傷性藥物后進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色，KA損傷組Hoechst 33258熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和cleavedcaspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均非常顯著大于對(duì)照組(P<0.01，P<0.01)。結(jié)果提示：KA能夠?qū)w外培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞造成損傷，表現(xiàn)為降低神經(jīng)細(xì)胞的存活，減少細(xì)胞體、突起數(shù)及最長(zhǎng)突起的生長(zhǎng)與發(fā)育；還可以引起細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，活化caspase3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 2．MK-801對(duì)KA損傷胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作

21、用 研究表明，KA的興奮性毒性作用中有著NMDA受體的介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用NMDA受體拮抗劑MK-801作為陽(yáng)性對(duì)照組，利用顯微測(cè)量、免疫組化、熒光染色等方法，觀察了MK-801對(duì)KA損傷胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作用并初步探討其保護(hù)作用的機(jī)制。 細(xì)胞培養(yǎng)第5天加入MK-801，6小時(shí)后加入KA，24小時(shí)后，MK-801+KA組細(xì)胞存活數(shù)、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為25.05+1.73個(gè)/視野、1.3

22、2±0.30個(gè)/細(xì)胞和58.62±6.431μm，與對(duì)照組組相比顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)。胞體平均直徑為10.59±1.51μm，較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，與KA組相比顯著增多 (P<0.05)。 MK-801+KA組存活NSE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為20.05+1.91個(gè)/視野、1.35±0

23、.31個(gè)/細(xì)胞和58.024±6.85μm，與對(duì)照組組相比顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)；胞體平均面積為145.27±19.54，較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05)。GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)、胞體平均面積和平均每細(xì)胞突起數(shù)量分別為4.90±0.60個(gè)/視野、748.84±70.02和1.25±0.26/細(xì)胞，與

24、對(duì)照組組相比顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)。Hoechst 33258凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量以及cleaved-caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比均顯著增多(P<0.05，P<0.05)，與KA組相比均顯著減少(P<0.05，P<0.05)。 結(jié)果提示：MK-801對(duì)KA誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)細(xì)胞興奮性損傷有保護(hù)作用。其促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞、NSE、G

25、FAP陽(yáng)性細(xì)胞的存活，對(duì)胞體及突起有一定的保護(hù)作用。該神經(jīng)保護(hù)作用與其可以抑制caspase-3活化、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。3．GB對(duì)KA損傷胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作用 研究表明，GB在許多病理情況下能減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡，發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中用顯微測(cè)量、免疫組化、熒光染色等方法，觀察了GB對(duì)KA損傷胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作用，并初步探討了其作用機(jī)制。 細(xì)胞培養(yǎng)第5天加入GB，6小時(shí)后加

26、入KA，24小時(shí)后，存活細(xì)胞數(shù)、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為為24.354±1.67個(gè)/視野、1.294±0.25個(gè)/細(xì)胞和56.46±6.03μm，與對(duì)照組組相比顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)。胞體平均直徑為10.484±1.45μm，較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05)。 GB+KA組NS

27、E陽(yáng)性神經(jīng)元存活數(shù)量、平均每細(xì)胞突起數(shù)量和平均最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度分別為為20.25±2.01/視野、1.31±0.27個(gè)/細(xì)胞和57.35±6.12μm，與對(duì)照組組相比顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)；胞體平均面積為142.124±15.21，較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05)。GB+KA組GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)、胞

28、體平均面積和平均每細(xì)胞突起數(shù)量分別為4.40±0.63個(gè)視野、751.24±69.28和1.24±0.22個(gè)/細(xì)胞，與對(duì)照組組相比顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，與KA組相比顯著增多(P<0.05，P<0.05，P<0.05)。Hoechst 33258凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量以及cleaVed-caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比均顯著增多(P<0.05，P<0.05)，與KA組相比均顯著減少(P<0.05，P<0.

29、05)。 結(jié)果提示：GB具有減輕KA引起的體外培養(yǎng)大鼠胚胎脊髓神經(jīng)細(xì)胞興奮性損傷的保護(hù)作用，具體表現(xiàn)為促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞、NSE、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的存活，防止GB對(duì)神經(jīng)細(xì)胞胞體及突起的損傷，該作用與抑制caspase-3活化和減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究得出以下結(jié)論： (1)GB促進(jìn)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)發(fā)育。 (2)GB促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞、NSE、GFAP、AChE陽(yáng)性細(xì)

30、胞的存活、胞體及突起發(fā)育的作用與NGF一致，而其促進(jìn)神經(jīng)突起分化與生長(zhǎng)的作用強(qiáng)于NGF。(3)GB能夠減輕KA誘導(dǎo)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞興奮性損傷。其促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞、NSE、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的存活，對(duì)細(xì)胞胞體及突起分化和生長(zhǎng)的保護(hù)作用與MK-801一致。 (4)GB的神經(jīng)保護(hù)作用與其抑制caspase-3活化、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。 總之，本實(shí)驗(yàn)旨在探討GB促進(jìn)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及其神經(jīng)保護(hù)作