1、第一部分人退變椎間盤髓核細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:通過人退變髓核細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，獲取足夠的髓核細胞供后續(xù)實驗研究。
　　 方法:應(yīng)用0.25％的胰酶聯(lián)合0.2％Ⅱ型膠原酶消化法從腰椎間盤突出癥患者退變髓核組織中獲取髓核細胞，用COL2α1免疫細胞化學(xué)、CD24-PE細胞表面標記鑒定，并用β-半乳糖苷酶染色判定髓核細胞的衰老比例。
　　 結(jié)果:從退變腰椎間盤髓核組織中成功獲取原代退變髓核細胞并進

2、行傳代培養(yǎng)。然后應(yīng)用COL2α1抗體對細胞進行免疫細胞化學(xué)染色和CD24-PE細胞表面標記物鑒定，證實培養(yǎng)的細胞為髓核細胞。β-半乳糖苷酶染色法發(fā)現(xiàn)退變髓核細胞的衰老比例較高。
　　 結(jié)論:應(yīng)用酶聯(lián)合消化法能成功獲得原代退變髓核細胞，并能進行傳代培養(yǎng)，從而提供足夠的細胞來源供進一步研究。退變的髓核細胞中衰老細胞比例較高。
　　 第二部分低強度脈沖超聲對立體培養(yǎng)的人退變椎間盤髓核細胞的影響初步實驗研究
　　 目的:

3、探討不同超聲強度的低強度脈沖超聲對三維立體培養(yǎng)的人退變髓核細胞的影響。
　　 方法:取第一部分實驗中獲取的P2代退變髓核細胞轉(zhuǎn)至藻酸鈣凝珠三維立體培養(yǎng)后予以不同超聲強度(0、15、30、60、120mW/cm2)的脈沖超聲刺激1周（20min/天）。分別用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，RT-PCR技術(shù)及western blot技術(shù)檢測細胞中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原在mRNA及蛋白水平的表達差異。
　　 結(jié)果:超聲強度為30、60、

4、120mW/cm2組的細胞凋亡率較對照組(0mW/cm2)組低，差異有顯著性(P＜0.05)，超聲強度為15mW/cm2組與對照組相比差異無顯著性(P＞0.05);在蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的mRNA及蛋白表達水平上，30、60、120mW/cm2組與對照組相比均有顯著性升高。
　　 結(jié)論:低強度脈沖超聲能抑制體外藻酸鈣凝珠立體培養(yǎng)的人退變髓核細胞凋亡，促進細胞合成細胞外基質(zhì)，從而延緩或修復(fù)椎間盤退變。
　　 第三部分

5、　　 低強度脈沖超聲對立體培養(yǎng)的人退變椎間盤髓核細胞的影響分子機制研究
　　 目的:探討低強度脈沖超聲對體外立體培養(yǎng)的人退變髓核細胞的影響及分子機制。
　　 方法:取第一部分實驗中獲取的P2代退變髓核細胞轉(zhuǎn)至藻酸鈣凝珠中三維立體培養(yǎng)。根據(jù)第二部分實驗結(jié)果選擇超聲強度為30mW/cm2的LIPUS進行研究，實驗分組如下:control組:除不予超聲刺激外同條件培養(yǎng)1周;LIPUS組:予以超聲刺激1周，20min/天;LI

6、PUS+LY294002組:予以超聲刺激并加入LY294002共培養(yǎng)1周。應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡。應(yīng)用ELISA法檢測上清中退變髓核細胞分泌的aggrecan、COL2α1、MMP-3和TIMP-1的濃度;應(yīng)用RT-PCR法和Western Blot法檢測細胞中aggrecan、COL2α1和Sox9在mRNA和蛋白水平的表達差異;應(yīng)用Western Blot法檢測細胞中activecaspase-3、Bcl-2、FAK、Akt、p

7、-FAK及p-Akt的表達差異。
　　 結(jié)果:予以LIPUS刺激后，上清中的aggrecan、COL2α1和TIMP-1濃度較對照組升高(P＜0.05)，MMP-3濃度下降(P＜0.05)。予以LIPUS刺激后，細胞內(nèi)aggrecan、COL2α1和Sox9在mRNA及蛋白水平的表達與對照組比較均有明顯增高，F(xiàn)AK、Akt蛋白的表達無明顯變化，Bcl-2、p-FAK、p-Akt蛋白的表達增高，active caspase-3蛋白