1、嗅球(OB)的中間神經元具有終生更新的能力，它們在胚胎期主要由外側神經節(jié)突起區(qū)(LGE)的神經干細胞(NSCs)遷移、分化而來；出生后，則主要由位于室管膜前下區(qū)(SVZa)的NSCs遷移、分化而來?；蛐酒夹g提供了一個可以同時研究多個基因動態(tài)改變的技術平臺。本課題采用16，844點的高密度Oligo基因芯片對發(fā)育期小鼠前腦四個時間點(Embryonicday16(E16)，Postnatalday1(P1)、P7和P21)、三個部位(

2、OB、RMS及SVZa)的基因表達情況加以研究，探討在鏈式遷移過程中NSCs增殖、遷移及分化的分子機制，有以下發(fā)現： 一、基因芯片實驗部分基因芯片采用北京博奧生物公司16，844點的小鼠Oligo芯片，實驗設計采用Ⅱ型設計，并進行熒光交換實驗。實驗組樣品為同一時間點、同一部位組織混合后得到的12個樣品，共同對照樣品由四個時間點小鼠全腦總RNA等量混合而成。芯片雜交后，將掃描圖像信號轉換為數字信號，然后對數據用非線性方法進行標準化

3、處理，芯片上的每一個基因都會得到熒光交換前后的2個表達比值(Ratio)，只有在兩次雜交實驗中變化趨勢相同的基因才被認為是真正有差異表達的基因。進而將同一基因熒光交換前后的2個Ratio值取其幾何平均數作為該基因表達的Ratio值，共得到12組表達數據，這些數據是后續(xù)研究小鼠前腦基因表達時空分布特點的基礎。 二、基因芯片數據驗證部分從基因芯片結果中挑選12個組織都表達的基因--同源盒轉錄因子2(Distal-lesshomeob

4、ox2，DLX2)，采用SYBRGreenⅠ實時相對定量熒光RT-PCR技術檢測DLX2基因在發(fā)育小鼠前腦中的表達情況，并將所得結果與基因芯片數據相比較，以此驗證芯片數據的可靠性。通過比較，兩組數據的表達變化趨勢基本一致，也間接證實芯片數據結果的可靠性，后者也是進一步統(tǒng)計分析得出可靠結果的基礎。 三、基因芯片數據初步統(tǒng)計學分析主要采用系統(tǒng)聚類、基因表達調控網絡及統(tǒng)計分析中常用的方法等對芯片數據進行了初步分析。 1、首先將

5、基因分成“活動”基因和“差異”基因?！盎顒印被颍涸谒膫€時間點中都有表達的基因，有表達的點包括表達沒有顯著改變、上調、下調、開和關基因?！安町悺被颍菏紫缺仨殲椤盎顒印被颍€要求四個時間點中最大Ratio值/最小Ratio值的比值大于2。 2、以“活動”基因的標準在原始數據中進行篩選，并對這些“活動”基因按組織的分布進行分類，得到三組基因只在一種組織內表達的基因(OB：64；RMS：223；SVZa：687)，三組基因只在兩種

6、組織內表達的基因(OB_RMS：64；OB_SVZa：423；SVZa_RMS：372)，三個組織都表達的“活動”基因有1847個。1847個“活動”基因按功能進行分類，除了Unclassified基因外，Metabolism，Transport及Signal功能組包含的數目最多。1847個基因組織聚類分為6大功能類，C(1)-541、C(2)-194、C(3)-421、C(4)-114、C(5)-343、C(6)-324。功能分布分析

7、顯示Transport功能組在各聚類族中分布是不同的。1847個基因空間聚類顯示，在兩個或三個組織中有6組基因的表達趨勢相似，提示這些基因在NSCs的增殖、遷移及分化中，在不同的部位有著相似的表達模式。同時也發(fā)現RMS含有與其它兩個部位表達趨勢相似最多的基因，而OB與SVZa之間最少。對1847個基因分組織功能分布分析顯示，各功能組分別在三個組織的聚類族中分布相同，說明各功能組分別在三個組織發(fā)育中的分布是隨機的。對它們分組織進行候選基因

8、篩選顯示，三個部位中候選基因的個數分別為：Celldifferentiation(OB：2，RMS：2，SVZa：2)，Responsetostress(OB：2，RMS：2，SVZa：2)，Development(OB：16，RMS：14，SVZa：15)，其中Development功能組的候選基因數目最多。時點變換分析中以相關系數(Correlationcoefficient，CC)大于+0.99和小于-0.99作為有意義的正相關和

9、負相關的分類標準，并對基因進行相關分類，從這些基因中挑選出了有意義的基因。 3、以“差異”基因的分類標準在原始數據中進行篩選，得到三組基因只在一種組織內表達的基因(OB：149；RMS：616；SVZa：342)，三組基因只在兩種組織內表達的基因(OB_RMS：118；OB_SVZa：89；SVZa_RMS：252)，三個組織都表達的“差異”基因有267個。267個三個組織都表達的“差異”基因按功能進行分類中，除了Unclass

10、ified基因外，Metabolism，Transport及Development發(fā)育功能組包含的數目最多。267個基因組織聚類分為8大功能類：C(1)-15、C(2)-64、C(3)-26、C(4)-45、C(5)-33、C(6)-21、C(7)-38、C(8)-25。結果提示在P21時間點三個部位的“差異”基因表達趨勢高度相似，OB部位的三個時間點(E16，P1，P21)“差異”基因的表達趨勢穩(wěn)定。功能分布分析顯示每個功能組的分布都

11、為非隨機的?？臻g聚類發(fā)現在兩個或三個組織中有7組“差異”基因的表達趨勢相似，RMS含有與其它兩個部位表達趨勢相似最多的差異基因，而OB與SVZa之間最少。候選基因篩選分析顯示，Development功能組在三個部位中候選基因的數目最多，OB及RMS兩個部位只篩選到Development功能組候選基因。相關網絡分析中，在相關系數取大于+0.99或小于-0.99水平，得到26個基因，11個網絡。 4、三個組織各自的差異表達基因的系統(tǒng)

12、聚類分析中，分別得到如下差異表達基因：OB-623，RMS-1253，SVZa-950。對這些基因分別進行系統(tǒng)聚類分析顯示，OB組聚類后基因分為4類(C1-215，C2-158，C3-124，C4-126)，RMS組聚類后基因分為5類(C1-334，C2-93，C3-312，C4-301，C5-215)，SVZa組聚類后基因分為5類(C1-132，C2-268，C3-114，C4-292，C5-144)。三個組織各自的區(qū)域特異性差異表達

13、基因為：OB-149，RMS-616，SVZa-342。對這些基因分別進行系統(tǒng)聚類分析顯示，OB組聚類后基因分為4類(C1-44，C2-20，C3-39，C4-46)，RMS組聚類后基因分為7類(C1-30，C2-165，C3-48，C4-39，C5-103，C6-129，C7-102)，SVZa組聚類后基因分為6類(C1-50，C2-119，C3-16，C4-50，C5-99，C6-8)。 四、基因芯片生物學分析1、OB差異表

14、達基因中與酪氨酸羥化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)相關基因的研究。通過對623個OB不同發(fā)育階段的共表達差異基因的聚類分析，進而對這些基因進行了基因調控網絡分析，在相關系數設定為+0.95和-0.95水平上，共篩選出18個與TH相關的基因。18個基因中已知功能的基因有8個，未知功能的基因有10個。實驗結果顯示，這18個基因與TH基因間有較高的相關性，它們參與了TH基因的表達調控。通過18個基因在OB差異基因聚類分析中

15、位置的研究，得到C1組7個、C2組3個、C3組2個、C4組6個。 2、OB、RMS及SVZa差異表達基因中與DLX2相關基因的研究。通過基因調控網絡分析三個組織中DLX2相關基因的研究顯示：OB中相關系數設定為+0.95和-0.95的水平時，共篩選出29個與DLX2相關的基因。29個基因在OB差異基因聚類分析基因分類中的位置研究，得到C1組5個，C2組4個，C3組8個，C4組12個；RMS中在相關系數設定為+0.99和-0.99

16、的水平時，共篩選出43個與DLX2相關的基因。43個基因在RMS差異基因聚類分析基因分類中的位置研究，得到C1組29個，C2組0個，C3組13個，C4組0個，C5組1個。SVZa中在相關系數設定為+0.995和-0.995的水平時，共篩選出34個與DLX2相關的基因。34個基因在SVZa差異基因聚類分析基因分類中的位置研究，得到C1組0個，C2組23個，C3組0個，C4組11個，C5組0個。本研究的結果顯示，這些基因分別在不同的部位與D