1、第一部分中國(guó)幼年及成年強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA-B27多態(tài)性分布特點(diǎn)研究
　　 背景：強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一種具有高度遺傳性的常見風(fēng)濕性疾病，主要侵犯脊柱和骶髂關(guān)節(jié)，致殘率高，人群發(fā)病率約0.3％。AS與HLA-B27強(qiáng)相關(guān)。已證實(shí)因遺傳因素和地理位置的差異，B27亞群在各種族人群中分布不同。在中國(guó)大陸，有關(guān)B27等位基因在AS患者中的分布還沒有大型的研究。
　　 目的：研究

2、中國(guó)漢族幼年及成年強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA-B27亞型分布情況，并分析此兩種臨床類型患者的B27亞型分布是否存在差異。
　　 方法：AS患者共505例，來自2005年1月-2008年12月本院風(fēng)濕科門診及病房，為中國(guó)漢族人群，16歲以下起病者為幼年強(qiáng)直性脊柱炎(JAS)，共145例，16歲以上起病者為成年強(qiáng)直性脊柱炎(AAS)，共360例?；颊邼M足1984年修訂的強(qiáng)直性脊柱炎紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)。與JAS組及AAS的年齡、性別相匹配的健康

3、志愿者對(duì)照組共1368例，其中匹配JAS對(duì)照組156例，匹配AAS對(duì)照組1212例。鹽析法提取基因組DNA。用Luminex液態(tài)芯片，結(jié)合PCR-SSOP技術(shù)對(duì)HLA-B位點(diǎn)做低分辨分型(AccuPlexTM，Dynal-Invitrogen，美國(guó))。部分標(biāo)本用血清學(xué)方法(微量淋巴細(xì)胞毒法)檢測(cè)HLA-B27抗原。HLA-B27陽性者進(jìn)一步用PCR-SSP方法做高分辨B27亞型檢測(cè)(Dynal-Invitrogen，美國(guó))。PCR-SS

4、P法分型為HLA-B*2715的樣本再行直接測(cè)序分型，驗(yàn)證結(jié)果。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.AS患者505例中，B27陽性453例，總陽性率89.7％，而1368例健康對(duì)照中B27陽性74例，總陽性率5.41％，二者差異有顯著性(P<0.001)。
　　 2.HLA-B*2704在AS組顯著高于對(duì)照組(P<0.001)；而B*2705顯著低于對(duì)照組(P<0.001)；B*2

5、715和B*2702在B27陽性患者組中分別占1.32％和0.66％，而對(duì)照組均為0，但與對(duì)照組問無顯著差異(P均>0.05)。
　　 3.JAS組出現(xiàn)3種亞型(B*2704、B*2705和B*2715)，AAS組出現(xiàn)4種亞型(B*2704，B*2705，B*2715和B*2702)，兩組B27亞群分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。
　　 4.攜帶B*2715等位基因的有三例JAS和3例AAS患者，其中JAS的起病年齡

6、分別為5、9、13歲。
　　 5.共5個(gè)B27亞型出現(xiàn)于健康對(duì)照人群(B*2704，05，03，06和07)，與JAS和AAS匹配的兩個(gè)健康志愿者對(duì)照組各亞群間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.HLA-B*2704是中國(guó)JAS和AAS患者的主要亞型，與AS相關(guān)。
　　 2.HLA-B27亞型分布在JAS和AAS患者兩組間無顯著性差異。
　　 3.HLA-B*2715作為HL

7、A-B27罕見亞型，只發(fā)現(xiàn)于AS患者，是潛在的參與AS致病相關(guān)的HLA-B27亞型。
　　 第二部分幼年AS患者HLA-B27各亞型臨床表現(xiàn)及B27等位基因致病機(jī)制初步研究
　　 --不同HLA-B27亞型患者M(jìn)MP-3、sRANKL和OPG變化及意義
　　 背景：癥狀出現(xiàn)于16歲以前的強(qiáng)直性脊柱炎定義為幼年強(qiáng)直性脊柱炎(JAS)，占AS的10％-20％。JAS臨床表現(xiàn)與成人AS不同，而B27亞型與臨床表現(xiàn)的關(guān)系

8、在成人已有較多報(bào)道，在JAS中有待更多研究。研究顯示JAS功能預(yù)后可能更差，而近年AS患者骨丟失、骨質(zhì)疏松的狀況受到重視，研究JAS中是否有骨代謝的異常及骨代謝相關(guān)因子與炎癥因子的關(guān)系，對(duì)臨床診治、改善預(yù)后有積極意義。
　　 目的：1.在第一部分B27基因分型的基礎(chǔ)上，探討JAS和AAS患者B27不同亞型間臨床表現(xiàn)的差異及JAS組內(nèi)各亞型臨床表現(xiàn)的差異；2.檢測(cè)JAS組患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)、可溶性核因子NF-

9、kB受體活化因子配體(sRANKL)和骨保護(hù)素(OPG)水平，探討各指標(biāo)與JAS臨床特征的相關(guān)性及不同亞型患者問血清水平有否差異。
　　 方法：JAS組患者145例，其中檢測(cè)MMP-3、sRANKL和OPG的患者分別為56例、62例和68例。AAS組患者360例。血清學(xué)檢查健康志愿者對(duì)照組32例。同時(shí)收集患者病史、體檢、強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)指數(shù)(BASDAI)、功能指數(shù)(BASFI)及實(shí)驗(yàn)室檢查資料。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELI

10、SA)檢測(cè)JAS患者和健康志愿者血清MMP-3、sRANKL和OPG水平，并與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析。
　　 結(jié)論：
　　 1.JAS臨床特征與AAS有差異，JAS男性比例、肌腱端炎及髖受累更多見，尤其髖受累者預(yù)后較差，臨床應(yīng)積極治療，減少殘疾。
　　 2.JAS組B*2704、05和15亞型問臨床特征、MMP-3、sRANKL及OPG的變化無明顯差異。
　　 3.JAS患者中sRANKL表達(dá)顯著增高，提示

11、患者有破骨代謝增強(qiáng)，在JAS患者的診治中應(yīng)關(guān)注骨代謝異常的情況。
　　 第三部分 AS患者HLA-B*2715等位基因致病相關(guān)機(jī)制的初步探討
　　 第一章一個(gè)HLA-B*2715的AS家系患者臨床特點(diǎn)、全基因組SNPs連鎖分析和血清MMP-3、sRANKL和OPG變化及意義探討
　　 背景：強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種主要侵犯中軸關(guān)節(jié)及外周大關(guān)節(jié)的慢性進(jìn)行性炎癥性疾病。通過分子遺傳學(xué)技術(shù)，對(duì)AS的家系、孿生子和病例

12、-對(duì)照進(jìn)行研究，證實(shí)AS足以B27為主要易感基因的多基因遺傳病。單核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism，SNP)是繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩種遺傳標(biāo)記后的第三代遺傳標(biāo)記，在復(fù)雜疾病的遺傳學(xué)研究中成為新的研究工具。HLA-B*2715是出現(xiàn)于亞洲的罕見B27亞型，對(duì)一攜帶此基因的AS家系，進(jìn)行臨床、免疫學(xué)及SNPs研究，有助于探討此等位基因與AS的相關(guān)性及其致病機(jī)制。
　　 目的

13、：通過收集家系臨床資料、對(duì)成員的B*2715基因進(jìn)行SNPs掃描分析及檢測(cè)炎癥及骨代謝指標(biāo)，探討此亞型的特征，以助揭示AS的發(fā)病機(jī)制。。
　　 方法：收集14位家系成員臨床資料；用含620901個(gè)SNPs的高密度基因芯片HumanHap610-quad chip在Illumina Infinium arrays上對(duì)患者B*2715基因進(jìn)行SNPs分型；用ELISA方法檢測(cè)13例成員血清MMP-3、sRANKL和OPG水平。

14、>　　 結(jié)論：
　　 1.本家系攜帶B*2715的成員AS發(fā)病率高，提示B*2715是與AS相關(guān)的亞型。
　　 2.雖然B*2715基因SNP的LOD值小于1,因本家系樣本只有7例，不能排除B*2715是AS的易感基因，需繼續(xù)積累病例驗(yàn)證。
　　 第二章 HLA-B*2715基因真核細(xì)胞慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
　　 背景：強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種具高度遺傳性的疾病。1973年發(fā)現(xiàn)HLA-B27與A

15、S的強(qiáng)相關(guān)以來，許多證據(jù)表明B27直接參與了發(fā)病，認(rèn)為B27分子是AS的原發(fā)關(guān)聯(lián)成分。HLA-B27具有多個(gè)亞型，B2705分布最廣，是祖先亞型，研究認(rèn)為其他亞型是由B*2705基因發(fā)生突變、移位或其他機(jī)制形成。因此，大多數(shù)對(duì)B27亞型的基礎(chǔ)研究都是圍繞B*2705進(jìn)行。目前被認(rèn)為與AS致病密切相關(guān)的亞型主要有B*2702、B*2704、B*2705等。見于亞洲的B*2706可能是一種保護(hù)性基因，而亞洲的另一基因B*2715，因出現(xiàn)頻率

16、低和發(fā)現(xiàn)時(shí)間短，研究結(jié)果較少，與AS之間的關(guān)系尚不清楚，本課題前期研究顯示攜帶此基因的散發(fā)患者發(fā)病時(shí)間早，而家系成員AS發(fā)病率高，提示可能是與AS相關(guān)的亞型，故將此基因的克隆載體轉(zhuǎn)入單核細(xì)胞系，體外研究其功能，將有助于探討B(tài)*2715與AS的相關(guān)性及致病機(jī)制。
　　 目的：構(gòu)建HLA-B*2715慢病毒載體，轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞系，建立穩(wěn)定表達(dá)B*2715基因的細(xì)胞，以研究該基因的功能。
　　 方法：全基因合成法合成HLA-

17、B*2715 cDNA序列，構(gòu)建pUC57-B*2715質(zhì)粒載體(用于保存cDNA)，酶切及測(cè)序鑒定；構(gòu)建PL-B*2715-GFP目的穿梭質(zhì)粒載體，酶切鑒定；在293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝(四質(zhì)粒系統(tǒng)，其中目的穿梭質(zhì)粒含有能表達(dá)綠色熒光蛋白的GFP基因)；慢病毒轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞(單核細(xì)胞系)及對(duì)照細(xì)胞293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：pUC57-B*2715載體及PL-B*2715-GFP目的穿梭質(zhì)