1、肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是當(dāng)今世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其死亡率占世界腫瘤中的第3位,每年全球大約有550,000個(gè)新增肝癌病例,超過(guò)所有惡性腫瘤的5％,但是目前臨床上的治療結(jié)果仍然不容樂(lè)觀(guān)。因此探尋更有效的治療方法是目前迫在眉睫之事,而傳統(tǒng)中藥則因其固有的優(yōu)點(diǎn)無(wú)疑是研究肝癌治療新藥物的重要資源。
　　 近年來(lái)就發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥中的土貝母是一種有效的抗腫瘤藥物。土貝母Bolbostemm

2、a paniculatum(Maxim.)Franquet(Cucurbitaceae)為葫蘆科假貝母屬植物,很早就在中國(guó)被廣泛用于炎癥、蛇毒等的治療,1765年出版的《本草綱目拾遺》中已有記載。土貝母被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗癌作用后更是受到廣泛的關(guān)注,并從中成功提取出了有效成分,土貝母苷甲。土貝母苷甲是一種三萜皂苷,已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明土貝母苷甲可以抑制體外培養(yǎng)的多種人類(lèi)癌細(xì)胞的生長(zhǎng),包括人早幼粒白血病細(xì)胞株(HL-60)、子宮頸癌細(xì)胞株(HeL

3、a cells)和鼻咽癌細(xì)胞株(CNE-2Z)等癌細(xì)胞。這些體外研究結(jié)果都提示土貝母苷甲有可能是一種有效的抗癌藥物成分。然而土貝母苷申對(duì)肝癌的抗腫瘤活性尚未見(jiàn)報(bào)道,而且動(dòng)物模型的藥代動(dòng)力學(xué)顯示,土貝母苷甲在肝臟中的含量最高,所以土貝母苷甲很有可能對(duì)肝癌的治療效果更佳。因此,有必要研究土貝母苷甲對(duì)肝癌的抗腫瘤活性及其相關(guān)機(jī)制。
　　 本課題主要針對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞,并以正常肝細(xì)胞株L-02細(xì)胞作為對(duì)照,研究了土

4、貝母苷甲對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。同時(shí),鑒于腫瘤的發(fā)生發(fā)展除了因?yàn)榧?xì)胞增殖和分化異常外,細(xì)胞凋亡異常也是關(guān)鍵的機(jī)制,進(jìn)一步研究了土貝母苷甲誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制。另外,本課題還研究了土貝母苷甲對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲、細(xì)胞骨架剛度等生物力學(xué)行為或性質(zhì)的影響,并對(duì)相應(yīng)的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。這些研究為更全面深入地認(rèn)識(shí)土貝母苷甲作用于肝癌細(xì)胞,如HepG2細(xì)胞的過(guò)程和機(jī)制奠定了基礎(chǔ),為進(jìn)一步研究土貝母苷甲用于臨床治療肝癌提供

5、了一定的理論依據(jù)。本課題研究取得的主要結(jié)果如下:
　　 ①土貝母苷甲抑制體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞的生長(zhǎng):采用MTT法試驗(yàn)的結(jié)果表明,土貝母苷甲對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞(HepG2、HCCLM3)和正常肝細(xì)胞(L-02、QSG-7701)的生長(zhǎng)均有抑制作用,并呈明顯的時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。重要的是,肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞對(duì)土貝母苷甲的抑制作用表現(xiàn)出不同的響應(yīng),尤其是在10-30μM的濃度范圍內(nèi),肝癌細(xì)胞對(duì)于土貝母苷甲作用的敏感性顯著地高于正

6、常肝細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期結(jié)果表明土貝母苷甲對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制可能與藥物將細(xì)胞阻滯于G2/M期有關(guān)。
　　 ②土貝母苷甲誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡:采用相差細(xì)胞顯微術(shù)和Hoechst33258染色劑標(biāo)記細(xì)胞核的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)不同濃度的土貝母苷甲處理后,HepG2細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)皺縮、變圓,細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、斷裂等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變;采用Tubulin-Tracker熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞微管骨架也由不加土貝母時(shí)明亮的紅

7、色熒光、從細(xì)胞中心發(fā)射狀排列分布到出現(xiàn)細(xì)胞周?chē)鸁晒鈴?qiáng)度減弱、無(wú)定形排列、細(xì)胞膜易位、細(xì)胞形態(tài)變圓等顯示細(xì)胞微管骨架解聚的現(xiàn)象。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AnnexinV/PI雙染色法標(biāo)記細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著土貝母苷甲濃度的增加,HepG細(xì)胞和L-02細(xì)胞中早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量都相應(yīng)增加,但是在較低濃度時(shí)(e.g.≤15μM)時(shí),早期凋亡的細(xì)胞比例與晚期凋亡的細(xì)胞比例差別并不明顯,當(dāng)濃度較高(e.g.=30μM)的時(shí)候,早期凋亡的細(xì)胞比例

8、遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)晚期凋亡的細(xì)胞比例,暗示土貝母苷甲在較高濃度的時(shí)候可能更傾向于促進(jìn)細(xì)胞的早期凋亡。另一方面,在同等濃度下,土貝母苷甲對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用要大于對(duì)L-02細(xì)胞的作用,這與其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果相一致。
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HepG2細(xì)胞在經(jīng)過(guò)土貝母苷甲作用后,其線(xiàn)粒體膜電位下降,細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體中釋放到細(xì)胞漿中,caspase-3和-9的活性增高,抗凋亡蛋

9、白Bcl-2表達(dá)降低,而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高,以及Bax和Bcl-2表達(dá)的相對(duì)比率不斷增高等。這些結(jié)果說(shuō)明了線(xiàn)粒體途徑參與了土貝母苷甲誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程。
　　 ③土貝母苷甲抑制肝癌細(xì)胞遷移與侵襲:腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征,也是直接影響肝癌患者治療效果和預(yù)后的重要原因。本課題的研究顯示,土貝母苷甲可以有效抑制HepG2細(xì)胞的遷移與侵襲。采用對(duì)細(xì)胞F-actin骨架的熒光染色和共聚焦顯微鏡觀(guān)察

10、顯示,經(jīng)土貝母苷甲作用后的HepG2細(xì)胞內(nèi)F-actin骨架有明顯的破壞跡象。明膠酶譜法檢測(cè)結(jié)果則顯示經(jīng)土貝母苷甲作用后的HepG2細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低。這些結(jié)果說(shuō)明土貝母苷甲可能通過(guò)破壞細(xì)胞微絲的結(jié)構(gòu)和抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲。
　　 ④土貝母苷甲改變肝癌細(xì)胞的生物力學(xué)性質(zhì):根據(jù)土貝母苷甲對(duì)肝癌細(xì)胞F-actin骨架結(jié)構(gòu)的作用,我們推測(cè)土貝母苷甲對(duì)細(xì)胞剛度等生

11、物力學(xué)性質(zhì)也有相應(yīng)的影響。為了驗(yàn)證這一點(diǎn),我們采用光學(xué)磁微粒扭轉(zhuǎn)系統(tǒng)(OMTC)測(cè)量了細(xì)胞剛度及其受土貝母苷甲的影響。結(jié)果顯示,土貝母苷甲確實(shí)降低了細(xì)胞的剛度,和細(xì)胞與加載頻率間冪率關(guān)系(G～fα)的冪值。此外,HepG2細(xì)胞較L-02細(xì)胞的本底剛度低,但對(duì)土貝母苷甲作用的反應(yīng)相應(yīng)更快。這些結(jié)果首次揭示了土貝母苷甲對(duì)HepG2細(xì)胞的F-actin骨架生物力學(xué)性質(zhì)的影響,而細(xì)胞骨架生物力學(xué)性質(zhì)對(duì)細(xì)胞變形、遷移、侵襲、分化等許多重要的生物學(xué)

12、行為都起著決定性的作用。
　　 綜上所述,土貝母苷甲對(duì)肝癌(HepG2)細(xì)胞生長(zhǎng)確實(shí)存在顯著的抑制作用,而對(duì)正常肝細(xì)胞(L-02)生長(zhǎng)的抑制作用則相對(duì)較弱。土貝母苷甲對(duì)肝癌(HepG2)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用主要通過(guò)由微管和線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制實(shí)現(xiàn)。但另一方面,土貝母苷甲對(duì)微絲骨架結(jié)構(gòu)也有破壞作用,從而影響肝癌細(xì)胞的剛度和動(dòng)力學(xué)特性,以及相應(yīng)的肝癌細(xì)胞遷移與侵襲能力。所以,土貝母苷甲不僅能抑制肝癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng),同是也能抑制肝癌