1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　肝細(xì)胞性肝癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其死亡率居世界第三位，五年生存率不到5％。肝細(xì)胞性肝癌具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差的特點(diǎn)，其中侵襲和轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。因而，抗肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，減少術(shù)后復(fù)發(fā)成為當(dāng)今肝癌防治領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多環(huán)節(jié)的過(guò)程，近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mes

2、enchymalTransition，EMT)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，抑制EMT將對(duì)肝癌晚期防治具有重大意義。EMT是一個(gè)連續(xù)的、多步驟的過(guò)程，它是指上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞能改變表型成為更容易遷移和侵襲的間質(zhì)表型細(xì)胞，其過(guò)程表現(xiàn)為:1、上皮粘附能力和細(xì)胞極性喪失，如細(xì)胞間粘附連接(E-cadherin/catenins復(fù)合體)表達(dá)下調(diào);2、細(xì)胞骨架重排，向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，如間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(N-cadherin，Viment

3、in等)表達(dá)升高;3、基底膜中斷，形成新的細(xì)胞-基質(zhì)粘附等。
　　研究表明，生長(zhǎng)因子可與細(xì)胞膜特異性受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)TGF-β/Smads、PI3K/Akt、MAPK、Wnt/β-catenin、Notch等不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞骨架功能，破壞細(xì)胞間連接，進(jìn)而觸發(fā)EMT過(guò)程。通過(guò)調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug、Twist等，可以使上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，表現(xiàn)為E-鈣粘蛋白(E-cad

4、herin)、緊密連接蛋白(Occludin)等上皮細(xì)胞標(biāo)志物下調(diào)，N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物上調(diào)，從而啟動(dòng)EMT過(guò)程。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，因此對(duì)誘導(dǎo)EMT過(guò)程具有輔助作用。如何阻斷EMT的發(fā)生而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，為臨床防治腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移提供新

5、的思路和方法。
　　維康醇(Alternol)是一個(gè)分子量為352的新型單體化合物，是從紅豆杉樹(shù)皮中分離、選育到的1株高產(chǎn)紫杉醇(Paclitaxel，PTX)菌種發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的化合物。體外抗癌活性研究證實(shí)，維康醇對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株具有增殖抑制作用，然而維康醇對(duì)肝細(xì)胞性肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移作用尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本課題擬以肝癌細(xì)胞株HepG2為模型探討維康醇對(duì)人肝細(xì)胞性肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移作用及其可能的作用機(jī)理。
　　材料和方法

6、　　肝癌細(xì)胞株HepG2的傳代培養(yǎng)。MTT法檢測(cè)維康醇對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖抑制作用。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)維康醇對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2遷移能力的抑制作用。采用Transwell包被基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)維康醇對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2侵襲能力的抑制作用。應(yīng)用明膠酶譜和Westernbolt方法檢測(cè)維康醇對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)活性和蛋白表達(dá)的影響。采用免疫熒光法檢測(cè)維康醇對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG

7、2中EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)的影響。Westernblot檢測(cè)維康醇對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2中轉(zhuǎn)錄因子Twist表達(dá)的影響。
　　結(jié)果
　　1、不同濃度的維康醇作用于HepG2細(xì)胞24、48、72h，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:維康醇濃度為10μM，對(duì)HepG2細(xì)胞存在明顯的增殖抑制作用;維康醇濃度低于3μM時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用較弱。
　　2、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示維康醇呈劑量依賴

8、性地抑制TPA誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞的遷移。
　　3、Transwell包被基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)顯示維康醇呈劑量依賴性地抑制TPA誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲。
　　4、免疫熒光結(jié)果顯示，TPA下調(diào)了肝癌細(xì)胞HepG2中E-cadherin的表達(dá)，而維康醇上調(diào)了其表達(dá)。
　　5、明膠酶譜和Westernblot結(jié)果表明維康醇抑制了TPA誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞中MMP-9酶活性和蛋白表達(dá)的升高。
　　6、Western