1、肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是嚴重威脅人類健康的主要腫瘤之一。每年約有60-100萬新發(fā)病例,死亡人數(shù)高達60萬人次。目前HCC的主要治療手段仍然是手術治療,但治療率低、復發(fā)性高,預后差。HCC療效不盡如人意的最主要原因是診斷較晚。70％～80％的HCC病人發(fā)現(xiàn)時已到晚期,不能進行有效的根治性治療。研究和應用有效的、可耐受的治療肝癌的新藥仍然是未來長期的持續(xù)性工作。
　　 凋亡是參與維

2、持機體生理平衡的重要機制,與機體生長發(fā)育和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程都有著緊密的聯(lián)系。常用的化療藥物可以引起腫瘤細胞的凋亡,從而抑制腫瘤的生長。近年來,自噬作為另外一種細胞程序性死亡方式逐漸引起了人們的高度關注。自噬與凋亡一樣有著復雜的分子機制和調(diào)控機制,兩者之間存在著密切的聯(lián)系。
　　 從天然動植物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分是近年來研究的熱點之一。紫杉烷類的代表藥物紫杉醇(paclitaxel,PTX)是從紫杉樹樹皮中提

3、取的一種天然植物類抗腫瘤藥物。通過研究和臨床證實紫杉醇是乳腺癌和卵巢癌及非小細胞肺癌(NSCLC)的一線和二線治療藥物。維泰醇(alternol)是利用紅豆杉樹皮中分離、選育到的1株高產(chǎn)紫杉醇菌種發(fā)酵生產(chǎn)的新型單體化合物。體外抗腫瘤活性研究表明,維泰醇對20多種腫瘤細胞株的增殖具有抑制作用,殺傷率可達50％～99％不等;其抗瘤譜廣,抑瘤效果顯著。近年來紫杉烷類化合物化學研究焦點已轉(zhuǎn)向發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物并對已發(fā)現(xiàn)的化合物進行結(jié)構(gòu)上的改造,以

4、提高生物活性,增強療效,降低毒副作用。維康醇是在紫杉醇發(fā)酵過程中獲得的另一個化合物,其結(jié)構(gòu)和維泰醇非常相似,它的抗腫瘤活性以及其可能的作用機制值得我們進行詳細研究。
　　 本研究擬以肝癌細胞HepG-2為模型,應用MTT法、流式細胞術、熒光染色、以及Westernblot等方法,探討維康醇對肝癌的作用及其可能的作用機理。
　　 材料和方法：
　　 以不同濃度維康醇作用于HepG-2細胞一定時間后,利用MTT法檢測

5、其對細胞增殖的抑制率,流式細胞儀PI單染檢測細胞周期分布的情況,流式細胞儀AnnexinV/PI雙標記法檢測細胞凋亡率,MDC熒光染色檢測細胞自噬,以及WesternBlot技術檢測ERK、P38、JNK.MAPKs和自噬相關蛋白MAP-LC3的表達。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、維康醇對HepG-2細胞增殖的影響
　　 HepG-2細胞經(jīng)維康醇處理后,MTT法顯示維康醇對HepG-2細胞具有明顯的生長抑制作用并

6、呈時間劑量依賴性。經(jīng)檢驗,與對照組相比有明顯差異,P＜0.05或P＜0.01。當維康醇濃度達到10μM時,細胞抑制率顯著升高。
　　 2、流式細胞法分析細胞周期和凋亡
　　 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示3μM、10μM、30μM維康醇作用于HepG-2細胞48h后,處于S期和G2/M期的細胞比例升高,同時伴隨G1/G0期細胞比例下降,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或＜0.01)。Annexin-V/PI染色檢測顯

7、示,3μM、10μM、30μM維康醇作用于HepG-2細胞48h后的細胞凋亡率分別為7.52％、7.07和23.66％(溶劑對照組為7.21％)。
　　 3、MDC熒光染色檢測細胞自噬
　　 熒光顯微鏡下觀察到,不同濃度維康醇作用于HepG-2細胞48h后,細胞出現(xiàn)的自噬泡逐漸增加,藥物濃度達到3μ時自噬泡的數(shù)量最多,繼續(xù)加大濃度,自噬泡的數(shù)量減少。3-MA(2mM)預處理1h后再加入1μM的維康醇作用48h,可見空泡量

8、明顯減少。
　　 4、蛋白質(zhì)印跡檢測相關蛋白水平的表達
　　 Westernblot檢測結(jié)果顯示,10μM維康醇可以顯著上調(diào)LC3-Ⅱ的表達水平,隨著藥物濃度的升高,p-P38和p-ERK蛋白水平的表達逐漸增高,但p-JNK沒有顯著變化。
　　 結(jié)論：
　　 1、維康醇抑制肝癌細胞HepG-2的增殖,并具有濃度和時間依賴性。
　　 2、維康醇在低劑量時,誘導HepG-2細胞的自噬作用;在高劑量時誘