1、1.背景與目的：
　　 血管內皮損傷是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和經皮冠脈介入術(percutaneous coronary intervention，PCI)后血管再狹窄的一個主要的病理生理基礎。因此，內皮的修復和再生成為治療心血管疾病的關鍵策略。雖然內皮細胞(Endothelial cells，ECs)通常被認為只有依靠鄰近成熟ECs才能被修復和再生。然而，由于ECs屬于終末分化細胞，增殖能力較低，

2、極大地限制了其在治療上的應用。
　　 內皮祖細胞(Endothelial precusor cells，EPCs)是一種特殊類型的骨髓祖細胞，是血管ECs的前體細胞。它能夠進入循環(huán)，增殖并分化為ECs，但尚未表達成熟血管ECs表型，也未形成血管。EPCs是包括了從血管母細胞到成熟ECs之間多個階段的細胞。修復血管內皮主要和早期EPCs密切相關；而晚期EPCs則隨著其增殖能力的增強，在血管生成中發(fā)揮作用。既往的許多基礎和臨床研究已

3、經證實EPCs可以歸巢到血管損傷的部位、分化為ECs，進而替代受損傷的內皮。因此，EPCs在出生后缺血組織的血管新生、維持正常內皮功能和修復損傷血管內皮等方面都發(fā)揮著極其重要的作用。
　　 血小板源生長因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)最初從血小板中分離出來。PDGF是由四種不同多肽鏈(PDGF-A，-B，-C，-D)通過二硫鍵連接的五種糖蛋白異構體(PDGF-AA，-BB，-AB，-

4、CC，-DD)組成的家族。這五種PDGF二聚體以不同的親和力和PDGFR-α、PDGFR-β、PDGFR-αβ特異性結合。而作為有著很強的促細胞分裂增殖能力和趨化作用的PDGF-BB，是唯一能與α、β、αβ三種受體亞單位結合的因子。事實上，PDGF-BB或者PDGFR-β和血管增生性疾病，例如AS和PCI后再狹窄的發(fā)病機制密切相關。有證據表明，PDGF-BB或PDGFR-β可以促進AS病變形成以及PCI后的血管損傷引起的內膜增生。并且，

5、在動物模型上也觀察到使用PDGF或PDGFR的特異性阻滯劑能夠抑制動脈內膜損傷后新生內膜的增生。
　　 以往的研究表明，PDGF-BB和PDGFR-β之間的相互作用對細胞的增殖和遷移至關重要。我們注意到，PDGF-BB和PDGFR-β的相互作用可以誘導PDGFR磷酸化和激活磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)。而PI3K信號通路，也同樣參與許多細胞進程，包括細胞增殖、存活、運動和血管生成。

6、
　　 在損傷血管的ECs再生中，EPCs始終發(fā)揮著重要的作用。而基于PDGF-BB和PDGFR-β的生物學功能，我們推測PDGF-BB和PDGFR-β可能和EPCs增殖、遷移和血管生成有潛在的聯(lián)系，并且能夠參與新生血管形成和血管損傷后的修復過程。因此，在本實驗中，我們通過過表達PDGFR-β評估PDGF-BB在EPCs增殖、遷移和血管新生中所發(fā)揮的作用。此外，我們將過表達PDGFR-β的EPCs通過靜脈輸注到小鼠體內，觀察EP

7、Cs介導的血管內皮修復。我們的研究結果旨在為血管損傷的治療提供一個新的思路。
　　 2.方法：
　　 2.1.PDGFR-β在脾源性EPCs的表達
　　 2.1.1.EPCs培養(yǎng)和鑒定
　　 密度梯度離心法獲取小鼠脾臟單個核細胞(mononuclear cells，MNCs)，在添加20%優(yōu)質胎牛血清、VEGF10ng/ml的DMEM/F-12培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞生長、形態(tài)學變化；acLDL

8、-DiI攝取和UEA-I結合實驗觀察EPCs是否具有ECs功能特性；利用流式細胞儀進行細胞表面干細胞抗原及內皮細胞特異性抗原鑒定。
　　 2.1.2.PDGFR-β在EPCs的定位和表達
　　 2.1.2.1.免疫熒光檢測PDGFR-β在EPCs的細胞定位
　　 2.1.2.2.半定量PCR和Western blot檢測PDGFR-β在EPCs的表達
　　 2.2.基因轉染脾源性EPCs
　　 2

9、.2.1.脂質體介導的細胞轉染
　　 培養(yǎng)10-11天，融合率在60-70%以上的EPCs，利用LipofectamineTM2000進行質粒轉染。質粒DNA與LipofectamineTM2000的比率為1:2。為了觀察質粒的轉染效率，用激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP的熒光表達情況。
　　 2.2.2.計算轉染效率
　　 轉染效率= EGFP表達陽性細胞數/計數細胞總數。
　　 2.2.3.半定量PCR和

10、Western blot檢測PDGFR-β在EPCs的表達
　　 2.3.EPCs分泌的PDGF-BB
　　 為了比較未轉染和轉染了過表達PDGFR-β質粒的EPCs分泌PDGF-BB的濃度，我們將培養(yǎng)上清液用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進行了檢測。
　　 2.4.PDGF-BB對PDGFR-β過表達EPCs生物學功能的影響
　　 為了

11、觀察轉染外源性PDGFR-β和不同濃度的PDGF-BB刺激對EPCs生物學功能的影響，三組轉染了PDGFR-β的EPCs(對照組、pEGFP-N2組、pEGFP-N2-PDGFR-β組)分別加入不同濃度的PDGF-BB(0、10、20、40、80，或160 ng/ml)。
　　 2.4.1.PDGF-BB對PDGFR-β過表達EPCs增殖功能的影響
　　 用MTS測定EPCs的增殖變化。
　　 2.4.2.PDG

12、F-BB對PDGFR-β過表達EPCs遷移功能的影響
　　 用Transwell小室測定EPCs的遷移。
　　 2.4.3.PDGF-BB對PDGFR-β過表達EPCs血管生成功能的影響
　　 用基質膠測定EPCs體外血管生成能力。
　　 2.5.探討PDGFR-β/PI3K/Akt信號通路在PDGF-BB介導的EPCs生物學功能變化中的作用
　　 為了評價PDGFR-β/PI3K/Akt信號通路

13、是否參與PDGF-BB介導EPCs的生物學功能，兩組EPCs(對照組、pEGFP-N2-PDGFR-β組)在加入最大有效濃度的PDGF-BB前，分別被給予PDGFR-β酪氨酸磷酸化抑制劑AG1295、PI3K信號通路阻斷劑LY294002和Akt激酶抑制劑sc-221226預處理1h。
　　 2.5.1.EPCs增殖功能檢測
　　 用MTS測定EPCs的增殖變化。
　　 2.5.2.EPCs遷移功能檢測
　

14、　 用Transwell小室測定EPCs的遷移。
　　 2.5.3.EPCs血管生成功能檢測
　　 用基質膠測定EPCs體外血管生成能力。
　　 2.5.4.Western blot檢測PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平
　　 為了觀察PDGFR-β/PI3K/Akt信號通路是否參與調控EPCs，在給予PDGF-BB刺激和AG1295、LY294002、sc-221226預處理后，通過West

15、ern blot分別檢測PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平。
　　 2.6.PDGFR-β過表達EPCs在血管損傷修復過程中的作用
　　 2.6.1.建立小鼠頸動脈損傷模型
　　 2.6.2.PDGF-BB在被損傷血管上的定位和表達
　　 2.6.2.1.免疫熒光檢測PDGF-BB在被損傷血管上的定位
　　 2.6.2.2.實時定量PCR和Western blot檢測PDGF-BB在被損

16、傷血管上的表達
　　 2.6.3.脾源性EPCs移植
　　 小鼠行脾臟切除術后，再行頸動脈損傷。小鼠頸動脈損傷后，通過尾靜脈注射EGFP-EPCs或者PDGFR-β-EPCs。24h后再重復注射一次。
　　 2.6.4.EPCs示蹤
　　 用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞是否歸巢到血管損傷的局部，以及是否具有ECs表型。
　　 2.6.5.EPCs移植對血管再內皮化的影響
　　 為了評估血管再內

17、皮化，在損傷后的第7d獲取損傷側頸總動脈，冰凍切片后進行Evans blue染色。
　　 2.6.6.EPCs移植對血管新生內膜增厚的影響
　　 為了評估血管新生內膜厚度，在損傷后的第14d獲取損傷側頸總動脈冰凍切片，進行HE染色。
　　 2.6.7.PDGFR-β過表達EPCs對損傷后血管內膜細胞凋亡的影響
　　 為了檢測血管內膜細胞凋亡，在損傷后的第7d獲取損傷側頸總動脈，冰凍切片后進行TUNEL免疫

18、熒光染色。TUNEL的凋亡指數=標記陽性細胞數/總細胞數。
　　 3.結果：
　　 3.1.PDGFR-β在脾源性EPCs的表達
　　 3.1.1.EPCs鑒定
　　 3.1.1.1.EPCs的形態(tài)學特征
　　 倒置顯微鏡觀察可見：小鼠脾源性EPCs培養(yǎng)4-7d，呈梭形、紡錘形，具有內皮樣細胞形態(tài)。同時有細胞集落形成；10d可見細胞首尾相連，呈線狀排列；20d可見細胞相互融合，呈鋪路石狀。

19、　　 3.1.1.2.熒光雙染鑒定
　　 培養(yǎng)4-7d的EPCs，用acLDL-DiI和FITC-UEA-I進行染色。激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，細胞攝取acLDL-DiI呈現紅色熒光，結合FITC-UEA-I呈現綠色熒光，acLDL-DiI和FITC-UEA-I雙染色陽性細胞呈現黃色熒光，即為雙染陽性細胞。這些雙染的細胞被認為是正在分化的EPCs。我們實驗中培養(yǎng)的EPCs雙染陽性細胞數為91.2±1.8%。
　　 3

20、.1.1.3.分子表面標記表達鑒定
　　 利用流式細胞分析技術檢測培養(yǎng)7d的EPCs，貼壁細胞表面表達干細胞抗原Sca-1為71.7±0.93%；表達內皮細胞特異性抗原VEGFR-2為52.49±9.27%。
　　 3.1.2.PDGFR-β在EPCs的定位和表達
　　 3.1.2.1.免疫熒光檢測PDGFR-β在EPCs的細胞定位
　　 培養(yǎng)7d的EPCs，通過免疫熒光技術在激光共聚焦顯微鏡下檢測可見：

21、PDGFR-β在培養(yǎng)細胞的細胞膜上陽性表達率為88.6±4.3%，說明PDGFR-β主要定位在EPCs的細胞膜。
　　 3.1.2.2.半定量PCR和Western blot檢測PDGFR-β表達
　　 培養(yǎng)4、7、14、21d的EPCs，通過半定量RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現在EPCs有PDGFR-β mRNA和蛋白的表達。而且，隨著EPCs分化時間的延長，PDGFR-β mRNA和蛋白的表達逐漸增加

22、，但表達量均呈較低水平。
　　 3.2.基因轉染脾源性EPCs
　　 3.2.1.通過激光共聚焦顯微鏡觀察：在轉染后21h，可以看見被轉染的EPCs有EGFP熒光表達；而未被轉染的正常EPCs則沒有EGFP的熒光表達。
　　 3.2.2.計算轉染效率大概在50-60%。
　　 3.2.3.在轉染后72h，半定量RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現與空白對照組和pEGFP-N2空質粒轉染組相比較，

23、pEGFP-N2-PDGFR-β質粒轉染組PDGFR-β mRNA和蛋白在EPCs的表達顯著增高(P<0.01)。
　　 3.3.EPCs分泌的PDGF-BB
　　 PDGF-BB是一種分泌蛋白，在EPCs的培養(yǎng)液上清中，它的濃度是17.2±2.0 pg/ml。在轉染后48 h和72h，與空白對照組和pEGFP-N2空質粒轉染組相比較，pEGFP-N2-PDGFR-β組EPCs分泌的PDGF-BB濃度顯著降低(P<0.0

24、1)。
　　 3.4.PDGF-BB對PDGFR-β過表達EPCs生物學功能的影響
　　 3.4.1.PDGF-BB對PDGFR-β過表達EPCs增殖功能的影響
　　 PDGF-BB能夠顯著促進EPCs的增殖。在對照組和空白質粒組，其最大效應發(fā)生在20 ng/ml；在過表達PDGFR-β組，其最大效應發(fā)生在80 ng/ml。
　　 3.4.2.PDGF-BB對PDGFR-β過表達EPCs遷移功能的影響

25、r>　　 PDGF-BB能夠顯著促進EPCs的遷移。在對照組和空白質粒組，其最大效應發(fā)生在20 ng/ml：在過表達PDGFR-β組，其最大效應發(fā)生在80 ng/ml。
　　 3.4.3.PDGF-BB對PDGFR-β過表達EPCs血管生成功能的影響
　　 PDGF-BB能夠顯著促進EPCs的血管新生。在對照組和空白質粒組，其最大效應發(fā)生在20 ng/ml；在過表達PDGFR-β組，其最大效應發(fā)生在80 ng/ml。<

26、br>　　 3.5.PI3K/Akt信號通路在PDGF-BB介導的EPCs生物學功能變化中的作用
　　 3.5.1.EPCs增殖能力檢測
　　 經過AG1295、LY294002，或sc-221226預處理，PDGF-BB誘導EPCs增殖無論是在對照組(PDGF-BB20 ng/ml)還是在過表達PDGFR-β組(PDGF-BB80 ng/ml)均被顯著抑制。結果表明，PI3K/Akt信號通路參與了PDGF-BB誘導的

27、EPCs增殖。
　　 3.5.2.EPCs遷移功能檢測
　　 經過AG1295、LY294002，或sc-221226預處理，PDGF-BB誘導的EPCs遷移無論是在對照組(PDGF-BB20 ng/ml)還是在過表達PDGFR-β組(PDGF-BB80 ng/ml)均被顯著抑制。結果表明，PI3K/Akt信號通路參與了PDGF-BB誘導EPCs遷移。
　　 3.5.3.EPCs血管生成功能檢測
　　 經

28、過AG1295、LY294002，或sc-221226預處理，PDGF-BB誘導EPCs管型生成無論是在對照組(PDGF-BB20 ng/ml)還是在過表達PDGFR-β組(PDGF-BB80 ng/ml)均被顯著抑制。結果表明，PI3K/Akt信號通路參與了PDGF-BB誘導EPCs血管生成。
　　 3.5.4.Western blot檢測PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平
　　 經過AG1295、LY294

29、002，或sc-221226預處理后，PDGF-BB誘導EPCs的PDGFR-β、PI3K和Akt磷酸化蛋白活化水平減弱。
　　 3.6.PDGFR-β過表達EPCs在血管損傷修復過程中的作用
　　 3.6.1.小鼠頸動脈損傷模型的建立
　　 小鼠頸動脈損傷模型成功建立。HE染色證實：在頸動脈損傷后7d，鏡下出現可見的內膜增生；在頸動脈損傷后28d，新生內膜明顯增生。
　　 3.6.2.PDGF-BB在被

30、損傷的血管上的定位和表達
　　 3.6.2.1.免疫熒光檢測PDGF-BB在被損傷血管上的定位
　　 通過免疫熒光技術在激光共聚焦顯微鏡下檢測可見：在被損傷血管局部的內膜和中膜，有PDGF-BB表達。但是在正常血管則很少有PDGF-BB表達。
　　 3.6.2.2.實時定量PCR和Western blot檢測PDGF-BB在被損傷血管上的表達
　　 PDGF-BB mRNA和蛋白在正常血管組織低表達；血管

31、損傷后4d內表達變化不顯著；7d表達迅速上升達到高峰：之后逐漸下降，損傷后第21d基本恢復正常水平。
　　 3.6.3.EPCs示蹤
　　 EPCs移植后24h，通過激光共聚焦熒光顯微鏡可以在損傷血管局部觀察到攜帶綠色熒光的EGFP細胞。移植后10d，損傷血管部位可見vWF染色陽性，提示EPCs可歸巢于損傷血管部位，分化為ECs，直接參與損傷血管內皮的修復。
　　 3.6.4.PDGFR-β過表達EPCs對損傷后

32、血管再內皮化的影響
　　 通過Evans blue染色觀察發(fā)現，假手術對照組內皮無損傷，內皮覆蓋率為100%，而損傷組殘留內皮覆蓋率為0%，說明內皮剝脫完全。PDGFR-β過表達EPCs明顯促進第7d損傷血管的再內皮化，與相同時間點EGFP-EPCs移植組比較有顯著差異(P<0.05)，說明PDGFR-β過表達EPCs對損傷血管早期的再內皮化有促進作用。
　　 3.6.5.PDGFR-β過表達EPCs對損傷后血管內膜增生

33、的影響
　　 在血管損傷后第14 d，PDGFR-β過表達EPCs移植組血管組織內、中膜比值明顯低于EGFP-EPCs移植組的內、中膜比值(P<0.05)。說明過表達PDGFR-β EPCs抑制了小鼠頸動脈損傷后血管新生內膜的增厚。
　　 3.6.6.PDGFR-β過表達EPCs對損傷后血管中膜細胞凋亡的影響
　　 在血管損傷后第7d，PDGFR-β過表達EPCs移植組中膜細胞TUNEL凋亡指數明顯大于EGFP-

34、EPCs移植組(p<0.01)。說明PDGFR-β過表達EPCs對損傷血管早期的中膜細胞凋亡有促進作用。
　　 4.結論：
　　 4.1.小鼠脾臟中含有EPCs，在一定培養(yǎng)條件下可向內皮樣細胞分化；
　　 4.2.PDGFR-β在小鼠脾源性EPCs呈低表達，主要定位于細胞膜；
　　 4.3.PDGF-BB可促進EPCs的增殖、遷移和血管生成；
　　 4.4.過表達PDGFR-β通過PI3 K/Ak