1、腎母細胞瘤是小兒最常見的惡性實體腫瘤，在小兒外科疾病中占重要的地位。但是，至今腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子學機制仍然不明確。因此，深入探索腎母細胞瘤的發(fā)病機理，對尋找新的治療方法和提高患兒的生存率，具有重要的臨床價值和意義。Stat3（Signal transducer and activator of transcription protein3，Stat3）作為信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子家族的重要成員與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，但S

2、tat3在腎母細胞瘤中的作用及其機制目前知之甚少。本研究通過對腎母細胞瘤腫瘤標本和腫瘤細胞的系統(tǒng)研究，探討Stat3在腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用，并進一步闡明Stat3對腎母細胞瘤的作用機制，以期為腎母細胞瘤的生物治療提供一個新的靶點。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 Stat3在腎母細胞瘤腫瘤組織中的表達及其對腫瘤細胞活力和增殖的影響
　　目的：檢測Stat3在腎母細胞瘤組織標本中的表達，并觀

3、察Stat3對腎母細胞瘤細胞株G401細胞活力和增殖的影響，以了解Stat3信號通路在人腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。
　　方法：將22例腎母細胞瘤腫瘤組織及其瘤旁組織行定量PCR和Western blot，以測定Stat3的表達量。在G401細胞中以IL-6誘導Stat3活化或?qū)A-Stat3真核表達質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染G401細胞，然后運用MTT實驗和BrdU實驗檢測G401細胞活力和增殖情況。反之，以針對Stat3的

4、siRNAs阻斷Stat3信號通路，然后運用MTT實驗和BrdU實驗檢測G401細胞活力和增殖情況。
　　結(jié)果：Stat3 mRNA和蛋白在所有腫瘤組織中的表達率為100％，并且比瘤旁正常組織高表達(P＜0.05)。在G401細胞中以IL-6誘導Stat3活化或?qū)A-Stat3真核表達質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染G401細胞后，細胞內(nèi)Stat3高表達，腫瘤細胞活力和增殖能力增強(P＜0.05)。反之，以針對Stat3的siRNA阻斷St

5、at3信號通路后，細胞內(nèi)Stat3受抑制，腫瘤細胞活力和增殖能力降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：Stat3在人腎母細胞瘤中有廣泛的表達，Stat3與腎母細胞瘤細胞株的活力和增殖等諸多方面均有密切聯(lián)系。
　　第二部分 腎母細胞瘤中Stat3轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-370的表達
　　目的：探討在腎母細胞瘤中Stat3對miR-370的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及其分子機制。
　　方法：以IL-6誘導活化G401細胞中的Stat3，然后利

6、用miRNAs芯片篩選差異性miRNAs。利用生物信息學方法預測啟動子區(qū)域含有Stat3結(jié)合位點的差異性miRNA。在G401細胞中以IL-6誘導Stat3活化或?qū)A-Stat3真核表達質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染G401細胞使Stat3過表達，反之，以針對Stat3的siRNA阻斷Stat3信號通路，然后運用定量PCR測定miR-370的表達。將22例腎母細胞瘤腫瘤組織及其瘤旁組織行定量PCR以測定miR-370的表達，并分析Stat3和m

7、iR-370表達間的相關(guān)性。應用熒光素酶報告實驗、染色體免疫共沉淀技術(shù)驗證腎母細胞瘤中Stat3轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-370表達的分子機制。
　　結(jié)果：選擇差異倍數(shù)三倍以上、P值＜0.05的差異表達miRNAs進行聚類分析。在Stat3經(jīng)IL-6誘導活化的G401細胞中，表達上調(diào)的miRNAs共5個，表達下調(diào)的miRNA共4個。生物信息學方法預測發(fā)現(xiàn)miR-370編碼基因啟動子區(qū)域有Stat3的結(jié)合位點。在G401細胞中以IL-6誘導S

8、tat3活化或?qū)A-Stat3真核表達質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染G401細胞使Stat3過表達，定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-370的表達增高。反之，以針對Stat3的siRNA阻斷Stat3信號通路，定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-370的表達降低。將22例腎母細胞瘤腫瘤組織及其瘤旁組織行定量PCR，結(jié)果表達miR-370在腎母細胞瘤腫瘤組織中高表達并且與Stat3的表達呈正相關(guān)。在G401細胞中將CA-Stat3和報告質(zhì)粒PGL4-370.WT共

9、轉(zhuǎn)染后，進行熒光素酶基因報告實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G401細胞中Stat3高表達后，報告質(zhì)粒PGL4-370.WT的熒光活性增強(P＜0.05)，表明Stat3能夠靶定miR-370，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其表達。在G401細胞中以IL-6誘導活化Stat3或以siRNAs沉默Stat3后進行ChIP-PCR，結(jié)果顯示miR-370的引物能使Stat3組擴增較對照組明顯增加(P＜0.05)或下降(P＜0.05)，Stat3能與編碼miR-370的DNA

10、片段在其啟動子區(qū)域結(jié)合而調(diào)控miR-370的轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論：MiR-370在腎母細胞瘤腫瘤組織中高表達，并且與stat3的表達呈正相關(guān)。MiR-370是Stat3潛在的靶基因，Stat3在轉(zhuǎn)錄水平對miR-370進行調(diào)控。
　　第三部分 miR-370對腎母細胞瘤細胞活力和增殖的影響及其機制
　　目的：分析miR-370在腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，預測及鑒定miR-370的靶基因，明確其對腎母細胞瘤細胞活力和增殖的

11、影響。
　　方法：在G401細胞中以miR-370模擬物（miR-370 mimic）或miR-370抑制物(miR-370 inhibitor)將miR-370過表達或沉默后，運用MTT實驗和BrdU實驗檢測G401細胞活力和增殖，流式細胞術(shù)觀察細胞周期分布情況;同時，運用Westernblot檢測細胞周期相關(guān)蛋白的表達情況。利用生物信息學方法對miR-370的靶基因進行預測，并應用DAVID數(shù)據(jù)庫進行miR-370靶基因的功能

12、富集分析和信號轉(zhuǎn)導通路富集分析。然后，應用熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析miR-370與其潛在靶基因WTX相互作用的機制。在G401細胞中以miR-370 mimic或miR-370 inhibitor將miR-370過表達或沉默后，采用定量PCR和Western blot在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平評判miR-370對WTX的調(diào)控作用。最后，在G401細胞中以siRNAs靶向沉默WTX后，運用MTT實驗和BrdU實驗檢測G401細胞活力和增殖情況。

13、r>　　結(jié)果：G401細胞轉(zhuǎn)染miR-370 mimic后，MTT實驗和BrdU實驗顯示細胞活力和增殖增強(P＜0.05); FCM檢測發(fā)現(xiàn)處于S期的細胞增多(P＜0.05); Western blot顯示能夠阻止細胞通過G1/S期限制點而進入S期的p21和p27蛋白表達降低、而促使細胞從G1期進入S期的CyclinD1蛋白表達增多。反之，G401細胞轉(zhuǎn)染miR-370inhibitor后，上述實驗檢測發(fā)現(xiàn)細胞活力和增殖降低(P＜0.0

14、5)、處于S期的細胞減少(P＜0.05)、p21和p27蛋白表達增多、CyclinD1蛋白表達減少。生物信息學預測WTX為miR-370的靶基因，熒光素酶基因報告實驗證實miR-370可通過WTX的3'-UTR區(qū)域抑制WTX的轉(zhuǎn)錄(P＜0.05)。DAVID數(shù)據(jù)庫對靶基因功能富集分析和信號轉(zhuǎn)導通路富集分析提示miR-370可調(diào)控細胞周期。SiRNA靶向沉默WTX后細胞活力和增殖增強(P＜0.05)，說明對WTX進行RNA干擾，能夠取得與

15、過表達miR-370一致的生物學效應，證明miR-370能夠通過抑制WTX影響腎母細胞瘤細胞活力和增殖。
　　結(jié)論：miR-370通過抑制靶基因WTX提高腎母細胞瘤細胞活力、促進細胞增殖、調(diào)控細胞周期分布。由此可見，miR-370在Stat3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下通過WTX促進腎母細胞瘤細胞增殖。深入探討Stat3/miR-370/WTX調(diào)節(jié)軸在腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，不僅能夠深化我們對腎母細胞瘤的認識，也將有助于確定Stat3和miR