1、背景和目的:
　　 肺癌是臨床發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其死亡率居于各種惡性腫瘤之首，且全世界肺癌發(fā)病率還在以每年0.5％的速度增長。僅有20％-30％的肺癌患者可以早期得以診斷。盡管肺癌的診斷和治療手段不斷取得新的進展，但由于腫瘤轉移及多藥耐藥等問題，肺癌患者預后仍不佳，五年生存率僅為8-15％。中國也已成為世界上第一肺癌大國。按組織學類型可將肺癌分為兩大類:小細胞肺癌和非小細胞肺癌。小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的16％，且更具侵襲性，在

2、早期就能擴散到其它器官，且往往伴有骨轉移。
　　 目前肺癌的綜合治療措施仍是以手術為主，化療、放療為輔?；熓悄壳爸委熤小⑼砥谀[瘤的主要手段，缺點是對瘤體細胞產(chǎn)生殺傷作用的同時，對正常組織細胞也同樣產(chǎn)生殺傷作用，特別是對生長迅速的血細胞、骨髓細胞等損害更大?；焽乐氐母弊饔脤颊叩纳钯|(zhì)量有很大的影響。由于肺癌發(fā)現(xiàn)時多為晚期，許多病人已喪失了手術機會，同時化、放療耐受現(xiàn)象又較嚴重，預后很差。因此尋求新的有效的肺癌治療藥物，進一步

3、提高臨床療效，已成為厄待解決的臨床難題之一。
　　 多西環(huán)素是四環(huán)素類抗生素，其分子式為C22H24N2O8，分子量為444.435。具有抗炎、抗菌、神經(jīng)保護等廣泛的藥理作用。新近研究報道其對于多種腫瘤具有一定的細胞毒作用，包括舌癌、前列腺癌、直腸癌等。目前多西環(huán)素對小細胞肺癌細胞是否有抑制作用的研究尚未見報道。本實驗通過研究多西環(huán)素對小細胞肺腺癌細胞系NCI-H446增殖、凋亡、侵襲和轉移的影響，并探討其潛在的作用機制，以期為

4、深入闡明多西環(huán)素的抗腫瘤機制提供實驗基礎，為多西環(huán)素應用于臨床治療肺癌提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)探討多西環(huán)素對體外人小細胞肺癌H446細胞增殖的影響及其機制。①建立人小細胞肺癌H446細胞培養(yǎng)體系;多西環(huán)素作用于小細胞肺癌H446細胞一定時間段后，光鏡下觀察細胞形態(tài)學變化;②應用CCK-8法對各組細胞增殖抑制率進行檢測，共設2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml5個

5、濃度梯度，并設24、48、72、96小時共4個時間梯度;選用25μg/ml的5-氟尿嘧啶作為陽性對照藥物，同時設置空白對照組（不加藥），檢測各組相對生存率，計算增殖抑制率③平板克隆形成實驗檢測藥物處理后各組的克隆形成率;
　　 (2)探討多西環(huán)素對人小細胞肺癌H446細胞調(diào)亡的影響。①多西環(huán)素作用于H446細胞后，以Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下觀察細胞微觀結構的變化。②Tunel染色法檢測細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)③

6、AnnexinV-FITC/PI染色流式細胞術對藥物（0、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的多西環(huán)素及陽性對照藥物氟尿嘧啶）作用后H446細胞的早期調(diào)亡率進行檢測。
　　 (3)探討多西環(huán)素誘導人小細胞肺癌H446細胞凋亡的可能機制。以不同濃度的多西環(huán)素作用于H446細胞后，①采用Western blot法檢測藥物作用后H446細胞內(nèi)凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、caspase3、survivin表達水平的變化;②

7、采用Real-time PCR技術檢測多西環(huán)素藥物刺激對細胞內(nèi)Bax、Bcl-2、caspase3、survivin的mRNA表達水平的影響。
　　 (4)探討多西環(huán)素是否具有抑制人小細胞肺癌H446細胞遷移和侵襲的能力。①采用細胞劃痕實驗通過測量遷移距離評價多西環(huán)素對H446細胞的遷移能力的影響②采用Transwell實驗觀察多西環(huán)素對H446細胞的侵襲能力的影響。
　　 (5)探討多西環(huán)素影響人小細胞肺癌H446細胞

8、侵襲作用的機制:①采用ELISA法檢測各組細胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9及組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2的濃度水平②采用ELISA法檢測各組細胞上清液中血管內(nèi)皮生長因子VEGF的水平。
　　 (6)統(tǒng)計方法:結果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。隨機設計的多樣本資料進行單因素方差分析(One-way ANOVA)多重比較時，方差齊性時，選擇LSD法，方差不齊時選擇

9、近似F檢驗Welch法，多重比較方法選擇Dunnett's T3法。P＜0.05時認為有統(tǒng)計（學）差異。
　　 結果:
　　 (1)不同濃度的多西環(huán)素(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)分別作用H446細胞不同時間段后，結果表明隨著多西環(huán)素濃度和作用時間的增加，H446細胞存活率降低(p＜0.05）。多西環(huán)素作用24h、48h、72h、96h的IC50分別為24.10μg/m

10、l、10.98μg/ml、8.20μg/ml、8.03μg/ml。不同濃度的多西環(huán)素作用后，加藥組的克隆形成率明顯低于對照組。藥物濃度越高，克隆形成率越低。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml組的克隆形成率分別為（23.43±0.33）％、（11.74±0.64）％及(6.14±0.06)％，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。上述結果表明多西環(huán)素可時間-濃度依賴性的抑制人小細胞肺癌H446細胞

11、的增殖。
　　 (2)利用Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀察細胞的形態(tài);流式細胞術檢測藥物作用后細胞的凋亡率變化。結果:熒光顯微鏡下可見，陰性對照組H446細胞核界限清晰，圓形或橢圓形，呈均勻藍色熒光，染色較淺;不同濃度的多西環(huán)素(5、10、20μg/ml)處理48h后，可見細胞核染色不均一，胞核固縮、碎裂，染色質(zhì)凝集呈顆粒團狀分布;在tunel實驗中，陰性對照組少見明顯的細胞核被染成棕褐色。5μg/ml、10μg/

12、ml、20μg/ml的多西環(huán)素作用48h后，與陰性對照組相比均可見被深染的陽性細胞，低、中、高劑量組的凋亡指數(shù)分別為（33.17±0.45）％、(51.14±0.96)％、（64.13±0.09）％,與陰性對照組比較均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000);0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的多西環(huán)素作用24 h后，人小細胞肺癌H446細胞的早期凋亡率分別為（1.57％±0.06）％、（

13、1.83％±0.06）％、（3.17％±0.06）％和（3.43％±0.06）％。各加藥組與空白組相比均有統(tǒng)計學差異(P=0.001，P=0.000，P=0.000)。上述形態(tài)學變化及凋亡率結果均表明多西環(huán)素可濃度依賴性的誘導人小細胞肺癌H446細胞的凋亡。
　　 (3)通過Western Blot、Real-time PCR法檢測Bax、Bcl-2、caspase-3、survivin的蛋白和mRNA表達水平的變化，以探討多西

14、環(huán)素誘導人小細胞肺癌H446細胞凋亡作用的可能的機制。結果:多西環(huán)素作用于人小細胞肺癌H446細胞48小時后，10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素組H446細胞中Bcl-2 mRNA的相對含量明顯降低，相對含量分別為:0.78±0.02及0.39±0.03，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.008，P=0.003)。5μg/ml劑量組mRNA的相對含量為0.89±0.04，與陰性空白對照組比較無顯著性差異(P=0.159)。陽

15、性對照藥物氟尿嘧啶中Bcl-2 mRNA的相對含量為0.35±0.01，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.000);Bax的mRNA的相對含量明顯升高，5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素組Bax的mRNA的相對含量分別為:1.46±0.01、1.54±0.03、1.69±0.06，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.001，P=0.007，P=0.047)。陽性對照藥物氟尿嘧啶組Bax的mRNA的相對含量

16、為1.56±0.04，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.010);Caspase-3 mRNA的相對含量明顯升高，且有濃度依賴趨勢。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素組Caspase-3 mRNA的相對含量分別為:1.44±0.02、1.77±0.04、1.97±0.12，與陰性空白對照組比有統(tǒng)計學意義(P=0.001，P=0.035，P=0.019)。陽性對照藥物氟尿嘧啶中Caspase-3mRNA的相對含量

17、為1.93±0.01，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.036);survivin mRNA的相對含量明顯降低，且有濃度依賴趨勢。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素組survivin mRNA的相對含量分別為:0.44±0.01、0.31±0.01、0.12±0.00，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。陽性對照藥物氟尿嘧啶組survivinmRNA的相對含量為0

18、.93±0.02，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 Western Blot結果顯示:多西環(huán)素組組H446細胞中Bcl-2的蛋白表達量明顯降低，且有濃度依賴趨勢。低、中、高劑量Bcl-2的蛋白相對含量分別為:0.75±0.00、0.65±0.03、0.61±0.03，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.001，P=0.013，P=0.014)。陽性對照藥物氟尿嘧啶組Bcl-2的蛋白含量為0.62±

19、0.02，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.003);多西環(huán)素組組H446細胞中Bax的蛋白含量明顯增高，且有濃度依賴趨勢。低、中、高劑量組Bax的蛋白相對含量分別為:1.19±0.01、1.55±0.07、2.60±0.14，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.009，P=0.007)。陽性對照藥物氟尿嘧啶組Bax的蛋白相對含量為2.11±0.06，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.003);多西

20、環(huán)素組組H446細胞中caspase-3的蛋白含量明顯增高，且有濃度依賴趨勢。低、中、高劑量組casp嬲e-3的蛋白相對含量分別為1.35±0.00、1.77±0.03、1.86±0.04，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.003，P=0.004)。陽性對照藥物氟尿嘧啶組caspase-3的蛋白相對含量為1.10±0.03，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.001);多西環(huán)素組組H446細胞中surviv

21、in的蛋白含量明顯降低，且有濃度依賴趨勢。低、中、高劑量組survivin的蛋白相對含量分別為0.84±0.01、0.64±0.08、0.24±0.06，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.017、P=0.003)。陽性對照藥物氟尿嘧啶survivin的蛋白含量為0.35±0.04，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。
　　 (4)侵襲、轉移是惡性腫瘤最本質(zhì)的特性。本研究采用細胞劃痕實驗及t

22、ranswell實驗，觀察多西環(huán)素對H446細胞侵襲性和遷移能力的影響，結果表明，多西環(huán)素具有抑制人小細胞肺癌H446細胞侵襲能力的作用。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素作用48 h后，H446細胞的遷移距離由對照組的0.56±0.00分別縮短至0.43±0.01、0.32±0.01、0.11±0.00，與對照組結果比較差異均具顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。陽性對照組（氟尿嘧啶）與

23、對照組結果比較結果也具有統(tǒng)計學意義(P=0.000);5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml多西環(huán)素作用48 h后，穿過人工基底膜的H446細胞數(shù)由對照組的471.33±2.08分別減少至265.33±4.04、194.67±3.51和88.00±3.61;各組與陰性對照組比均有顯著統(tǒng)計學差異（P均＜0.01）。
　　 (5)研究多西環(huán)素影響H446細胞侵襲性和遷移能力的可能的機制。采用ELISA法檢測細胞上清液中基質(zhì)金屬

24、蛋白酶MMP-2、MMP-9、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2及水平血管內(nèi)皮生長因子VEGF的濃度水平。結果表明:多西環(huán)素組H446細胞上清液中MMP-2的含量明顯降低，且有濃度依賴趨勢。低、中、高劑量組MMP-2的含量分別為19.19±0.23 ng/ml、16.41±0.14 ng/ml、14.71±0.32 ng/ml，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。陽性對照藥物氟尿嘧啶組上

25、清液中MMP-2的含量為15.35±0.51ng/ml，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.000);多西環(huán)素組H446細胞上清液中MMP-9的含量明顯降低，且有濃度依賴趨勢。低、中、高劑量組MMP-9的含量分別為2.81±0.16 ng/ml、2.05±0.14 ng/ml、1.64±0.04 ng/ml，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.022，P=0.004，P=0.000)。陽性對照藥物氟尿嘧啶組上清液中MMP-9

26、的含量為1.42±0.05 ng/ml，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.000);多西環(huán)素組H446細胞上清液中TIMP-2的含量明顯增加，且有濃度依賴趨勢。低、中、高劑量組TIMP-2的含量分別為0.69±0.06ng/ml、0.99±0.07 ng/ml、1.37±0.02 ng/ml，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.005，P=0.000，P=0.000)。陽性對照藥物氟尿嘧啶上清液中TIMP-2的含量為1.2

27、1±0.07ng/ml，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.000);多西環(huán)素組H446細胞上清液中VEGF的含量明顯減少，且有濃度依賴趨勢。低、中、高劑量組VEGF的含量分別為286.88±3.14 ng/ml、260.37±3.66 ng/ml、230.93±5.30ng/ml，與陰性空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。陽性對照藥物氟尿嘧啶上清液中VEGF的含量為218.77±10.3

28、0 ng/ml，與陰性空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 結論
　　 多西環(huán)素對小細胞肺癌H446細胞的增殖具有抑制作用;5μg/ml-20μg/ml濃度范圍內(nèi)多西環(huán)素可濃度依賴性的誘導人小細胞肺癌H446細胞調(diào)亡;多西環(huán)素誘導細胞凋亡的作用可能與調(diào)節(jié)凋亡基因Bax、Bcl-2、caspase3、survivin有關;多西環(huán)素具有抑制人小細胞肺癌H446細胞遷移與侵襲的能力;多西環(huán)素可通過調(diào)節(jié)人小細胞肺