1、目的：探討染色體10q26上HTRA1啟動(dòng)子區(qū)域單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)與年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related Macular Degeneration，AMD)的關(guān)聯(lián)性以及HTRAI(HighTemperature Requirement FactorAl)在人眼各層次中的表達(dá)。 方法：1．以猶他州高加索人群為研究對(duì)象，采集各型AMD患者和對(duì)照組人群血樣并提取

2、DNA。2．以SNP rs11200638為中心選取染色體10q26上HTRA1基因內(nèi)或HTRA1上游的9個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)，通過(guò)單核苷酸引物延伸法對(duì)猶他州高加索人群中的各型AMD患者和種族、年齡相匹配的正常對(duì)照組人群進(jìn)行基因分型，并用卡方檢驗(yàn)檢測(cè)其與AMD的關(guān)聯(lián)性。3．從健康成年人血樣中提取RNA，通過(guò)RT-PCR克隆HTRA1基因的編碼區(qū)，在原核中進(jìn)行HTRAl重組蛋白的表達(dá)和純化，并用Western Blot檢測(cè)HTRA1重組蛋白的

3、抗原性。4．用兔抗人HTRA1多克隆抗體對(duì)AMD患者和正常人眼球冰凍切片進(jìn)行免疫組化反應(yīng)，檢測(cè)HTRAl在人眼各層次中的表達(dá)。 結(jié)果：1．SNP rsl1200638與晚期AMD的2種類型，GA和濕性AMD，具有幾乎一致的顯著關(guān)聯(lián)性，其與軟性玻璃膜疣也具有一定的關(guān)聯(lián)性，但比晚期AMD低。SNP rs10490924與各型AMD具有顯著的關(guān)聯(lián)性，但不及rsl1200638顯著。2．以pET32a為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒，在BL21細(xì)菌

4、中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，獲得高效的HTRA1重組蛋白表達(dá)。通過(guò)Ni-NTA蛋白純化柱純化，獲得高純度并具有抗原性的重組HTRA1蛋白。3.HTRA1在玻璃膜疣和新生血管組織上均有表達(dá)。 結(jié)論：1．HTRA1啟動(dòng)因子內(nèi)的rsl1200638除了與濕性AMD有關(guān)聯(lián)外與GA和軟性玻璃膜疣均有顯著的關(guān)聯(lián)性。HTRA1很可能是晚期AMD，包括GA和濕性AMD的主要危險(xiǎn)因子，對(duì)軟性玻璃膜疣的形成亦有一定的影響。2．由于His.Tag與Ni-NT