1、第一部分 Ezrin蛋白在骨肉瘤組織中的表達及其意義
　　目的:探討Ezrin蛋白在骨肉瘤組織中的表達及其與骨肉瘤臨床病理特征的關系。
　　方法:1.收集126例骨肉瘤組織石蠟標本及27例骨軟骨瘤組織石蠟標本，通過免疫組化染色檢測標本中Ezrin蛋白表達情況;2.分析骨肉瘤組織中Ezrin蛋白表達與患者性別、年齡以及腫瘤直徑、病理分型、Ennecking分期、位置、肺部轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關系。
　　結(jié)果:1.骨肉瘤組

2、織中Ezrin蛋白陽性率(81.74％)明顯高于骨軟骨瘤組織(29.63％)，差異有顯著性(x2=35.63，P＜0.01);2.伴有肺部轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中Ezrin蛋白陽性率(97.78％)較無肺部轉(zhuǎn)移者(72.84％)增加，差異有顯著性(x2=15.68，P＜0.05)，低分化骨肉瘤組織中Ezrin蛋白陽性率(94.87％)也高于中+高分化者(75.86％)（x2=12.32，P＜0.05），但是在不同性別、年齡、腫瘤直徑、Enne

3、cking分期及部位的骨肉瘤組織中Ezrin蛋白陽性率并無顯著性差異(均P＞0.05)。
　　結(jié)論:Ezrin蛋白在骨肉瘤組織中明顯升高，且與腫瘤肺轉(zhuǎn)移及惡性程度相關。
　　第二部分 Ezrin siRNA對MG-63細胞生物學行為的影響
　　目的:應用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)特異性下調(diào)Ezrin蛋白在骨肉瘤MG-63細胞中的表達，探討Ezrin蛋白在骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法:1.設計3對Ezr

4、in siRNA（Ezrin siRNA1、Ezrin siRNA2、EzrinsiRNA3），轉(zhuǎn)染MG-63細胞，采用熒光實時定量PCR、Western blotting檢測細胞Ezrin mRNA和蛋白表達水平，篩選出1對干預效果最好的Ezrin siRNA。2.將干預效果最好的Ezrin siRNA、Scramble siRNA分別轉(zhuǎn)染MG-63細胞，并設立1組未轉(zhuǎn)染的空白對照組，采用MTT法檢測細胞增殖;3.通過Transwel

5、l遷移、侵襲實驗檢測細胞的遷移、侵襲能力，細胞黏附實驗測定細胞的黏附能力4.利用Western blotting檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白、Src、磷酸化Src(p-Src)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)表達;5.30只裸鼠隨機分成3組:空白對照組(n=10)、Scramble siRNA組(n=10)和Ezrin siRNA組(n=10)，分別通過

6、鼠尾靜脈注射未轉(zhuǎn)染siRNA、轉(zhuǎn)染Scramble siRNA及EzrinsiRNA的MG-63細胞，第42天處死裸鼠，比較實驗前后體重及肺表面結(jié)節(jié)個數(shù)。
　　結(jié)果:1.Ezrin siRNA3對Ezrin mRNA和蛋白表達的抑制作用優(yōu)于Ezrin siRNA1、Ezrin siRNA2(P＜0.01)，因此本研究選擇EzrinsiRNA3進行后續(xù)研究;2.在24h、48h和72h，Ezrin siRNA組吸光度(OD)值小于空

7、白對照組、Scramble siRNA組(P＜0.05);3.Transwell遷移、侵襲實驗顯示，Ezrin siRNA組穿膜細胞數(shù)明顯低于空白對照組、Scramble siRNA組(P＜0.05)，同時，Ezrin siRNA組細胞黏附率較空白對照組、Scramble siRNA組降低(P＜0.05);4.與空白對照組、Scramble siRNA組比較，Ezrin siRNA組MMP-2、MMP-9、N-鈣粘蛋白、波形蛋白、p-S

8、rc、p-Akt表達水平降低(P＜0.01)，而E-鈣粘蛋白表達水平升高(P＜0.01)，但Src、Akt表達水平無變化(P＞0.05);5.Ezrin siRNA組實驗后裸鼠平均體重較空白對照組、Scramble siRNA組增加(P＜0.05)，但肺表面結(jié)節(jié)個數(shù)較空白對照組、Scramble siRNA組減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.運用siRNA下調(diào)Ezrin蛋白表達可抑制MG-63細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移;2.Ezri

9、n siRNA對MG-63細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的抑制作用是通過降低MMP-2、MMP-9、N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達、增加E-鈣粘蛋白表達以及抑制Src、Akt磷酸化實現(xiàn)的。
　　第三部分黃芩素通過抑制Ezrin表達和活性抑制MG-63細胞增殖、侵襲
　　目的:觀察黃芩素對MG-63細胞增殖、侵襲及Ezrin表達、活性的影響，探討黃芩素治療骨肉瘤的相關機制。
　　方法:1.體外培養(yǎng)MG-63細胞，利用無水乙醇將黃芩素稀釋成6

10、個濃度梯度:1、2、4、8、16、32μmol/L，分別處理細胞24h、48h、72h，采用MTT法檢測細胞增殖，選擇黃芩素干預48h，計算黃芩素作用的50％抑制濃度（50％ inhibitory concentration，IC50）;2.隨后以無水乙醇（對照組）及10、15μmol/L黃芩素處理MG-63細胞48h，采用Transwell遷移、侵襲實驗檢測各組細胞的遷移、侵襲能力;3.通過細胞黏附實驗測定細胞的黏附能力;4.行熒光實

11、時定量PCR、Westernblotting檢測Ezrin mRNA及Ezrin、磷酸化Ezrin(p-Ezrin)蛋白表達。
　　結(jié)果:1.隨著黃芩素濃度的增加和處理時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸升高，差異均有顯著性(P＜0.01)，黃芩素干預48h對MG-63細胞增殖的IC50約為18.35μmol/L;2.Transwell遷移、侵襲實驗顯示，10、15μmol/L黃芩素組穿膜細胞數(shù)均低于對照組(P＜0.05，0.01)，黃

12、芩素15μmol/L組穿膜細胞數(shù)又低于10μmol/L組（P＜0.05）;3.10、15μmol/L黃芩素組細胞黏附率較對照組降低(P＜0.05，0.01)，且黃芩素15μmol/L組細胞黏附率低于10μmol/L組(P＜0.05)，4.與對照組比較，10、15μmol/L黃芩素組Ezrin mRNA和Ezrin、p-Ezrin蛋白表達水平明顯降低，(P＜0.05，0.01)，黃芩素15μmol/L組上述指標低于10μmol/L組(P＜