1、本研究主要介紹硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及其在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行分析。論文共包括五部分試驗(yàn)：(1)硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及其序列分析。利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因全長(zhǎng)cDNA序列，全長(zhǎng)1345 bp，具有-1152 bp的開放閱讀框，編碼384個(gè)氨基酸，分子量約為41 kDa，通過序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，與所報(bào)道的真菌來源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列同

2、源性最高為72.2％，屬于糖苷水解酶家族5。該序列在GenBank上的登錄號(hào)為DQ328335。(2)β-甘露聚糖酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和特性研究?？寺ˇ?甘露聚糖酶基因成熟蛋白編碼序列到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)上，重組質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-mann，化學(xué)法轉(zhuǎn)化E coli BL21宿主菌，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，表達(dá)蛋白的分子量為43 kDa。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析

3、柱純化并經(jīng)變性復(fù)性處理后，表達(dá)蛋白酶活力為5.2 U/mL，表達(dá)量為25 mg/L，重組β-甘露聚糖酶的等電點(diǎn)為4.89。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH值為2.4，在pH 2.4-8.0和40℃以下具有很好的穩(wěn)定性。Western-blot分析結(jié)果表明，表達(dá)出的β-甘露聚糖酶具有很好的抗體特異性。(3)硫色曲霉β-甘露聚糖酶E206和E314定點(diǎn)突變分析。利用重疊延伸PCR法擴(kuò)增含突變的酶基因序列，克隆到pET-28a

4、(+)載體上，化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.coli Top10。篩選陽性克隆，導(dǎo)入E.coli BL21宿主菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析柱純化，酶活分析結(jié)果表明，突變重組酶未檢測(cè)到β-甘露聚糖酶活性。這一結(jié)果表明，谷氨酸E206和E314為硫色曲霉β-甘露聚糖酶的催化氨基酸。(4)野生型β-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)研究。將目的基因序列構(gòu)建到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZoA上，重組質(zhì)粒命名為pPICZαA-MANN，Sac Ⅰ線性

5、化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33宿主菌，Zeocin抗性篩選陽性克隆。Southern-blot和PCR結(jié)果表明，重組子整合到畢赤酵母基因組上，并具有很好的遺傳穩(wěn)定性。SDS-PAGE和Westem-blot分析表明，表達(dá)產(chǎn)物是分子量為48 kDa的糖基化蛋白。重組菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)96 h后，β-甘露聚糖酶活性和表達(dá)量最高，分別為96 U/mL和262 mg/L，蛋白純度達(dá)97％以上。酶學(xué)特性分析表明，所表達(dá)的β-甘露聚糖酶對(duì)半乳甘露聚糖具有高

6、度的特異性，最適pH為2.4，最適溫度為50℃，在pH 2.2-8.0和溫度低于40℃時(shí)穩(wěn)定，且β-甘露聚糖酶活力不受金屬離子(Ca<'2+>、Cu<'2+>、Mg<'2+>、 Zn<'2+>、Na<'2+>、Fe<'2+>和Mn<'2+>)和EDTA的顯著影響。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果表明，K<,m>和V<,max>分別為0.93 mg/mL和344.83 U/mg。(5)β-甘露聚糖酶基因密碼子優(yōu)化及其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。根據(jù)畢赤酵

7、母密碼子的偏好性，人工改造硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因序列，構(gòu)建到表達(dá)載體pPICZctA上，重組質(zhì)粒命名為pPICZαA-MAN-1，野生型重組子作為對(duì)照。重組子經(jīng)Sac Ⅰ線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33宿主菌，Zeocin抗性篩選陽性克隆。Southem-blot和PCR結(jié)果表明，重組子整合到畢赤酵母基因組上，并具有很好的遺傳穩(wěn)定性。在搖瓶水平上，密碼子優(yōu)化基因的重組子的酶活比野生型重組子提高32％。密碼子優(yōu)化基因的重組菌在10 L發(fā)