1、牛丘疹性口炎病(BPS)是牛的一種高度傳染性的、普遍存在的疾病，該病由牛丘疹性口炎病毒引起。它是能引起牛和人的一種急性、接觸性、嗜上皮性傳染病。牛丘疹性口炎病的特點(diǎn)是常在皮膚或嘴唇的粘膜，齒墊，上顎，舌頭，乳房，口角出現(xiàn)丘疹和潰瘍。在牛丘疹性口炎流行地區(qū)，發(fā)病率可高達(dá)90％以上，死亡率較低，但能使牛哺乳期中斷和產(chǎn)奶量下降，影響牛肉和皮的品質(zhì)，還會(huì)引起續(xù)發(fā)感染。國(guó)內(nèi)外對(duì)該病的致病機(jī)理還沒(méi)有系統(tǒng)的研究和報(bào)道，基因組序列的數(shù)據(jù)稀少，有關(guān)基因功

2、能的研究更加稀少，因此希望能夠通過(guò)我們的研究，為牛丘疹性口炎病的研究提供一定的基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.通過(guò)觀察牛病理特征，采集病料做病理切片，病毒接種于細(xì)胞分離，病毒形態(tài)電鏡顯示成卵圓形，以及PCR的特異性檢測(cè)，基因產(chǎn)物的測(cè)序和比對(duì)，檢測(cè)和分離到了牛丘疹性口炎病毒。
　　三歲的安格斯公牛，已有兩個(gè)月的慢性肩部感染，頸部、腹部皮膚有突起的結(jié)節(jié)，尸檢肩部出現(xiàn)膿腫膿液，多個(gè)淺表淋巴結(jié)腫大。并且在牛前肢兩側(cè)末端皮膚有慢性皮

3、膚增殖病和腫脹。四肢皮膚廣泛性病理增生，皮膚潰瘍出血病有灶融合。組織病理學(xué)檢查顯示前肢上皮乳頭狀增生、過(guò)度角質(zhì)化、真皮炎癥浸潤(rùn)。角化細(xì)胞氣球樣變性和可見(jiàn)到嗜酸性胞漿內(nèi)包涵體的等特征。電鏡檢查顯示出典型的卵圓形副痘病毒屬病毒粒子。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的牛丘疹性口炎病毒BPSV-024基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，并且用PCR技術(shù)從病毒(TX09)感染的細(xì)胞中擴(kuò)增到了預(yù)期的目的條帶。該擴(kuò)增的DNA序列通過(guò)核苷酸比對(duì)，結(jié)果顯示與牛丘疹性口炎病毒AR02株的

4、同源性達(dá)到100％，通過(guò)病理學(xué)，電鏡，PCR擴(kuò)增特異條帶，序列分析確定該病毒為牛丘疹性口炎病毒。
　　2.牛丘疹性口炎病毒全基因組測(cè)序與C5、C15和C1病毒的分離純化為了進(jìn)一步研究評(píng)估臨床分離的牛丘疹性口炎病毒基因組特性，用該病毒感染細(xì)胞并進(jìn)行病毒的DNA提取，用Illumina MiSeq平臺(tái)的第二代測(cè)序相關(guān)技術(shù)設(shè)備進(jìn)行全基因測(cè)序分析。根據(jù)對(duì)所得結(jié)果的初步分析，該序列和當(dāng)前已發(fā)表的基因庫(kù)序列牛丘疹性口炎病毒AR02株(基因庫(kù)A

5、cc.AY386265)，存在高度相似，值得注意的是，幾個(gè)基因位點(diǎn)有明顯的異質(zhì)性，表明臨床分離病毒中存在幾種基因型的情況。
　　從第一次分離的病毒，全基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，同一樣品中測(cè)序結(jié)果顯現(xiàn)出3種相似度很高的基因序列情況，為了便研究病毒基因的特性，命名為C5、C15、C1，我們用病毒蝕斑純化的方法進(jìn)行病毒的分離，根據(jù)其各自基因酶切位點(diǎn)的不同和基因的特異性，分別用stuⅠ酶酶切鑒定C5-VEGF和C15-VEFG基因來(lái)篩選C5和C15

6、病毒;PCR檢測(cè)特殊基因ATI，蝕斑行篩選純化C1病毒。通過(guò)多代的篩選純化，最終得到了相似度很高C5、C15、C1病毒。
　　3.對(duì)篩選到的牛丘疹性口炎病毒基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)
　　對(duì)篩選到的C5、C15和C1牛丘疹性口炎病毒，再進(jìn)行全基因測(cè)序，基因序列開放閱讀框(ORF)的確定使用EMBOSS工具和田納西州大學(xué)橡樹嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的Prodigal程序分析，分別找到了132個(gè)開放閱讀框，標(biāo)注了基因的起始和終止位置，并且和已經(jīng)發(fā)表的

7、牛丘疹性口瘡病毒基因庫(kù)序列AR02(基因庫(kù)Acc.AY386265)進(jìn)行比對(duì)。注明了其相對(duì)位置和標(biāo)注其蛋白功能，表格列出了3株病毒中差異明顯的開放閱讀框共17個(gè)(ORF006，ORF008，ORF009，ORF012，ORF020, ORF029, ORF102, ORF103, ORF104, ORF109, ORF110, ORF118,ORF119, ORF120, ORF123, ORF123,ORF124,ORF127)。

8、r>　　4.C5、C15和C1病毒動(dòng)物接種試驗(yàn)
　　用純化到的C5、C15和C1病毒感染細(xì)胞，不同時(shí)間段收病毒，檢測(cè)TCID50繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示C5、C15和C1病毒表現(xiàn)了類似生長(zhǎng)趨勢(shì)。并用病毒C5、C15和C1分別接種家兔進(jìn)行動(dòng)物接種試驗(yàn)，家兔在接種的7天顯現(xiàn)膿皰，第11天膿皰破潰，2周后結(jié)痂痊愈，且在結(jié)痂中檢測(cè)到了相應(yīng)的病毒。
　　5.用酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選了與C1-ORF118相互作用蛋白
　　以O(shè)RF1

9、18基因序列為模板，特異性引物擴(kuò)增ORF118基因，并連接到pGBKT7酵母表達(dá)載體上，構(gòu)建pGBKT7-ORF118誘餌載體，并對(duì)構(gòu)建好的誘餌載體進(jìn)行鑒定、自激活檢測(cè)和細(xì)胞毒性檢測(cè)。PCR結(jié)果和雙酶切得到了579bp大小目的條帶。誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Ⅱ8轉(zhuǎn)Y187和AH109感受態(tài)細(xì)胞，且培養(yǎng)于缺陷培養(yǎng)基SD/-TRP/-His、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu，培養(yǎng)基上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，在培養(yǎng)基S

10、D/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal僅生長(zhǎng)白色菌落，表明誘重組誘餌質(zhì)粒對(duì)Y2HGold酵母無(wú)毒性和自激活效應(yīng)?？梢杂糜贛DBK細(xì)胞的cDNA文庫(kù)進(jìn)行酵母雙雜交篩選。
　　利用酵母雙雜交技術(shù)，將所構(gòu)建的pGBKT7-118誘餌載體與MDBK的cDNA文庫(kù)進(jìn)行雜交，用SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu和SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-α-gal缺陷性固體培養(yǎng)基篩選相互作用的蛋白。經(jīng)過(guò)多輪篩選，得到了