1、副粘病毒為有包膜的負(fù)鏈RNA 病毒，是一類重要的人類和動物致病病毒，如尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、Menangle病毒等。1999年我們從因呼吸道感染而死亡的靈長類動物狨猴肺組織中分離到一株病毒，經(jīng)過一系列研究初步證實該病毒可能是一株副粘病毒，暫時命名為副粘病毒Tianjin株。在病原鑒定過程中，我們曾經(jīng)通過RT-PCR方法擴(kuò)增得到該毒株一段長為375 bp的片段，并將測序結(jié)果發(fā)送到互聯(lián)網(wǎng)

2、BLAST服務(wù)器進(jìn)行聯(lián)配檢索，發(fā)現(xiàn)其與仙臺病毒HN基因同源性較高，但推導(dǎo)出的氨基酸序列還存在較大差異。更重要的是，仙臺病毒是嚙齒類動物致死性病原體，然而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期間，飼養(yǎng)在同一實驗中心的各種實驗用鼠無一例發(fā)病。而且血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，動物中心工作人員都有此病毒的抗體；正常人群中對此病毒的抗體陽性率高達(dá)35％；患急性呼吸道感染的兒童抗體陽性率為19.28％，說明此病毒與人類關(guān)系密切，可能是仙臺病毒發(fā)生了某些變異而跨越了

3、種屬界限，形成對嚙齒類動物低致病性，而對靈長類動物乃至人類高致病性的毒株；或者是一株未被發(fā)現(xiàn)的能引起靈長類動物及人類呼吸道感染的新的副粘病毒。為進(jìn)一步明確其來源和種系進(jìn)化地位，闡明與人類疾病間的關(guān)系，我們從分子水平上對該病毒進(jìn)行了較為深入的研究。 首先，在第一部分工作中，我們在引物步移測序策略指導(dǎo)下對副粘病毒Tianjin株全基因組進(jìn)行了測序。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的仙臺病毒全基因組序列，設(shè)計了13對引物，以雞胚尿囊液中提取

4、出的病毒總RNA為模板，擴(kuò)增得到13個覆蓋整個基因組的相互重疊片斷，同時采用3’RACE 和 5’RACE 法對Tlqanjin株基因組末端序列進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)克隆、測序、拼接，最后得到了Tianjiin株的全基因組序列。結(jié)果表明，副粘病毒Tianjiin株基因組由15,384個核苷酸組成，與已知仙臺病毒基因組長度完全相同，遵循“六堿基原則”。從基因組的3’端至5，端依次排列著3’UTR，結(jié)構(gòu)基因NP、P、M、F、HN和L編碼區(qū)，以及5’U

5、TR。P 基因內(nèi)同樣包含了另外一重疊的開放閱讀框，且存在著一個保守的RNA 編輯位點(RNA editing site)3’UUUUUCCC-5’。推測除了編碼。NP、P、M、F、HN 和 L 六種病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白外，另外還可能編碼C、V、W等非結(jié)構(gòu)蛋白。Tianjin株各結(jié)構(gòu)基因的上下游均存在著保守的基因起始信號S和終止信號E，連接E和S的是一個保守的三核苷酸間隔區(qū)GAA或GGG。但是與己知仙臺病毒相比，Tianiin 株基因組結(jié)構(gòu)

6、中有兩處明顯不同，一是在HN基因和L基因間保守的S序列中有一個堿基發(fā)生突變(A8532G)：二是L基因終止密碼子突變(A15240C)，導(dǎo)致預(yù)測的Tianjin株L蛋白比已知仙臺病毒L蛋白多了一個氨基酸。比較巧合的是，仙臺病毒BB1株也在該點出現(xiàn)同樣的突變。這些突變有可能導(dǎo)致Tianjin株出現(xiàn)一些獨特的生物學(xué)特性。在本文第二部分工作中，我們對測序得到的 Tianjin 株全基因組序列進(jìn)行了較為全面的生物信息學(xué)分析。為了確定Tianji

7、n株在副粘病毒科中的分類地位，我們將Tianjin株與副粘病毒科25株病毒全基因組序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)化樹顯示，Tianjin株與仙臺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒3型和牛副流感病毒3型位于同一個分支，且與仙臺病毒親緣關(guān)系最接近，說明Tianjin株在分類上屬于副粘病毒科副粘病毒亞科呼吸道病毒屬。進(jìn)一步與GenBank中14株仙臺病毒全基因組序列比較，進(jìn)化樹顯示，Tianjiin株不屬于現(xiàn)有的三個分支，而是獨立為一個分支，同

8、源性分析同樣支持這一結(jié)果，因此Tianjin株應(yīng)被列為仙臺病毒第四種基因型。 另外，結(jié)構(gòu)基因推導(dǎo)出的氨基酸序列同源性比較顯示，P蛋白變異最大，雖然只有568 aa，卻含有29個獨特變異位點和35個與BB1共同具有的變異位點，與己知仙臺病毒同源性僅為78.7％～91.9％。比較其他仙臺病毒，也具有這樣的特點，說明P 蛋白有可能是仙臺病毒的特異性抗原。六個蛋白中，同源性最高的是L蛋白，為96.0％～98.0％，其次是M蛋白，為93.

9、1％～97.1％，說明二者較保守。氨基酸序列進(jìn)化樹分析顯示，六種結(jié)構(gòu)蛋白的進(jìn)化樹與基因組序列的進(jìn)化樹基本一致，僅有細(xì)微的不同，其中變化較大的是M蛋白。在M蛋白進(jìn)化樹中，Tianiin株與Ohita株和Hamamatsu 株代表的分支最接近，同源性也最高，為97.1％，與BB1株同源性為96.6％。而在其他蛋白進(jìn)化樹中，Tianjin株均與BB1株親緣關(guān)系最接近，同源性也最高。 基因組末端序列分析表明，Tianjin株3’和5’末

10、端分別含有55nt和57nt的前導(dǎo)區(qū)，且高度保守，與已知仙臺病毒同源性分別為89.1％～98.2％和93.0％～96.5％。而且3’端最前12個核苷酸和5’端最后12個核苷酸互補(bǔ)配對，這些特點均與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能密切相關(guān)。除此以外，我們還分析了Tianjin株基因組序列中核苷酸變異位點的分布，以及預(yù)測的結(jié)構(gòu)蛋白中氨基酸變異位點的意義。Tianjin株基因組全序列中共存在444個獨特的和546個與BB1株共有的核苷酸變異位點，其中嘌

11、呤-嘧啶之間的顛換突變分別占9.7％(43/444)和10.1％(55/54.6)。這些變異位點主要位于各個結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，從而導(dǎo)致Tianjin株結(jié)構(gòu)蛋白中存在著大量獨特的氨基酸變異位點。這些變異位點的存在提示Tianjin株有可能在生物學(xué)特性、致病性、免疫原性、流行病學(xué)等方面與其他仙臺病毒株具有很大的區(qū)別。關(guān)于這些變異位點與病毒生物學(xué)特性乃至致病性之間的關(guān)系，還有待將來采用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組病毒來證實。 綜上所述，本研究