1、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是多種水產(chǎn)動物的主要致病菌，還是引發(fā)食源性疾病的重要病原菌。研究表明，嗜水氣單胞菌可引起人的急性胃腸炎、敗血癥及傷口感染、中耳炎、腹膜炎等。目前，在國外已將嗜水氣單胞菌納入腹瀉病原菌的檢測范圍，是食品衛(wèi)生檢驗的對象；遲鈍愛德華氏菌是人魚共患的條件致病菌。因此，嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌不僅對養(yǎng)殖生產(chǎn)是一種威脅，對人的健康也是

2、一種潛在危險，檢測水產(chǎn)動物及食品中嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌具有重要的實際意義。 研究資料表明，嗜水氣單胞菌的致病性與氣溶素基因(aerA)、溶血素基因(hlyA)密切相關(guān)，這也是用于鑒別致病株與非致病株的關(guān)鍵因素；谷氨酸脫羧酶基因(gadB)是遲鈍愛德華菌七個毒力基因(orfA、citC、fimA、gadB、katB、mukF和ssrB)之一，只存在于致病菌株中而不存在于非致病菌株中。 本文在擴增上述毒力基因的基礎(chǔ)

3、上，建立了鑒定致病性嗜水氣單胞菌的多重PCR方法和能同時檢測致病性嗜水氣單胞菌與遲鈍愛德華氏菌的多重PCR方法，并用該方法及常規(guī)的微生物學(xué)方法對送檢樣品和水產(chǎn)養(yǎng)殖場水樣進(jìn)行了檢測。 試驗Ⅰ根據(jù)GenBank中登錄的相應(yīng)基因序列設(shè)計并合成三對特異性引物，擴增嗜水氣單胞菌aerA、hlyA基因和遲鈍愛德華氏菌gadB基因，克隆后送交ThKaRa公司測序，與GenBank中提交的相應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)aerA、hlyA

4、和gadB這三個基因與GenBank中提交的相應(yīng)核苷酸序列都有較高的同源性，其中aerA基因的核苷酸序列與AF539467參考株的同源性最高，達(dá)到99.8％；hlyA基因的核苷酸序列與AF146599參考株的同源性最高，達(dá)到97.9％；gadB基因的核苷酸序列與AY078505參考株的同源性最高，達(dá)到87.1％。說明所設(shè)計的引物具有較高的特異性和可靠性，為建立多重PCR方法奠定了基礎(chǔ)。 試驗Ⅱ根據(jù)試驗Ⅰ設(shè)計的引物擴增aerA、h

5、lyA基因，再輔以氣單胞菌屬所特有的內(nèi)參照基因16s rRNA，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化、多重PCR產(chǎn)物的測序鑒定與特異性和敏感性試驗，試圖建立一種檢測致病性嗜水氣單胞菌的多重PCR方法。對8株嗜水氣單胞菌、16株相關(guān)菌株進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果顯示非致病性分離株均未擴增出毒力基因hlyA和aerA，而致病性分離株則至少含有hlyA基因；對40份送檢的水產(chǎn)動物病料進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果與常規(guī)微生物學(xué)檢測符合率為97.5％。該方法具有

6、較高的敏感性與特異性，可檢測最低10 ng的模板。該試驗建立的方法可快速檢測水產(chǎn)動物及食品中的致病性嗜水氣單胞菌。 試驗Ⅲ根據(jù)試驗Ⅰ設(shè)計的引物擴增aerA、hlyA和gadB基因，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化、特異性和敏感性試驗，試圖建立一種可同時用于嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌檢測的多重PCR方法。對7株嗜水氣單胞菌分離株和3株遲鈍愛德華民菌分離株進(jìn)行多重PcR檢測，結(jié)果顯示非致病性分離株均未擴增出相關(guān)毒力基因，而致病性嗜水氣單

7、胞菌分離株則至少含有hlyA基因，致病性遲鈍愛德華氏菌含有g(shù)adB基因；對40份送檢的水產(chǎn)品樣品及12份養(yǎng)鰻場取的樣品進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果與常規(guī)微生物學(xué)檢測符合率分別為100％(愛德華氏菌)和98.1％(嗜水氣單胞菌)。該方法具有較高的敏感性與特異性，最低可檢測到10<'-9>g(ng)級。該方法的建立對水產(chǎn)動物感染致病性嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌的快速診斷和分子流行病學(xué)的調(diào)查有重要意義。 試驗Ⅳ從福建省某養(yǎng)鰻廠的養(yǎng)殖池

8、水體中分離出一株病原菌，該菌為革蘭氏陰性短桿菌，運動力陽性，氧化酶陽性，產(chǎn)生吲哚，葡萄糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、七葉靈、V-P陽性，根據(jù)菌落形態(tài)、生化特性及試驗Ⅱ建立的多重PCR方法，最后鑒定為嗜水氣單胞菌。致病性試驗結(jié)果顯示該分離菌具有較強的致病性，均能致死小白鼠和鰻魚。藥敏試驗結(jié)果表明，該菌對卡那霉素、氯霉素和呋喃唑酮、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等喹諾酮類藥物極為敏感。 試驗Ⅴ進(jìn)行了對喹諾酮類藥物敏感的嗜水氣單胞菌DNA旋

9、轉(zhuǎn)酶A亞單位(gyrA)基因的原核表達(dá)。喹諾酮類藥物是通過影響gyrA所催化的DNA超螺旋反應(yīng)過程中DNA裂解和重新組合步驟，從而阻斷細(xì)菌DNA復(fù)制，達(dá)到抑菌和殺菌目的，當(dāng)gyrA基因發(fā)生突變后往往意味著細(xì)菌對喹諾酮類藥物抗性的產(chǎn)生。本試驗根據(jù)GenBank中登錄的gyrA基因序列設(shè)計引物，運用PCR擴增出與預(yù)期大小相符的基因片段。將此基因片段克隆至質(zhì)粒pET30a(+)的EcoRI和XhoI位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)