1、肝細胞肝癌（簡稱肝癌）是世界上最常見、惡性度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第6位、死因第3位，是我國惡性腫瘤第2位死因。盡管近幾十年來對肝癌的基礎研究和診斷治療都取得了顯著進步，但肝癌患者的總體預后仍差，5年生存率不足5％。導致目前肝癌病人總體預后差的主要原因有兩個方面。一是多數患者未能早期發(fā)現、早期診斷和早期有效治療。近年隨著肝癌診斷和治療技術的進步，部分患者通過早期診斷及早期根治切除獲得了較好的療效，5年生存率達50％-60

2、％。但是目前只有10％-20％肝癌病人在診斷時具有根治性治療的機會。盡管甲胎蛋白(AFP)在肝癌的臨床診斷中得到了廣泛應用，但其對早期/小肝癌和AFP陰性肝癌的診斷仍存在明顯不足，迫切需要新的陽性率和敏感性更高的肝癌診斷指標，以進一步提高肝癌的早期診斷率。
　　肝癌患者預后差的另外一個重要原因是肝癌術后的高轉移復發(fā)率。據統(tǒng)計，肝癌患者術后5年轉移復發(fā)率高達60％-70％，即使小肝癌亦達40％，轉移復發(fā)已成為進一步提高肝癌治療效果的

3、另一個主要障礙。如能探明肝癌轉移的分子機理及其關鍵調控環(huán)節(jié)，將有助于探索有效的干預措施和治療手段，以進一步提高肝癌治療效果、延長病人生存。
　　本所前期采用基因芯片技術比較伴與不伴轉移肝癌之間、肝癌轉移灶與原發(fā)瘤之間基因表達譜的差異，在國際上首次提出促使肝癌轉移的基因改變始于原發(fā)腫瘤階段的新觀點(Ye QH，et al.Nat Med2003)，為肝癌轉移早期預測和分子干預奠定了理論基礎。最近，我們進一步將激光捕獲顯微切割(LCM

4、)和基因芯片技術相結合，研究伴和不伴肝外轉移肝癌原發(fā)瘤之間基因表達譜的差異，發(fā)現了以高爾基體Ⅱ型膜蛋白GOLPH2(typeⅡ Golgi membrane protein)為首的一組可能在肝癌轉移進程中起重要作用的候選基因，可能成為肝癌轉移的重要干預靶點。同時，我們還通過生物信息學分析方法在全基因組范圍內篩選出5個在肝癌組織中高表達的基因:MDK、PEG10、GPC3、SERPINI1和QP-C，其聯合組織檢測對肝癌診斷的敏感性達84

5、％（包括AFP陰性肝癌和小肝癌）。其中MDK為分泌性蛋白，可在血清中檢測，有望成為新的肝癌早期診斷血清學標記物(JaHL, et al.Clin Cancer Res2007)。
　　基于此，本課題首先通過大樣本、多中心檢測血清MDK在肝癌、特別是AFP陰性肝癌和小肝癌中的表達，分析其在肝癌早期診斷中的價值及其臨床意義。同時，對高爾基體膜蛋白GOLPH2在肝癌轉移進程中的重要作用及其關鍵調控環(huán)節(jié)進行系統(tǒng)研究，探討其作為肝癌轉移分子

6、干預靶點的可行性。
　　第一部分血清MDK對甲胎蛋白陰性肝癌和早期肝癌的診斷價值
　　目的:本研究通過檢測血清MDK評估其對肝癌特別是AFP陰性肝癌和早期肝癌的臨床診斷價值。
　　方法:通過組織芯片免疫組化染色檢測105例包含有肝癌及癌旁和肝硬化組織中MDK蛋白水平的表達情況。進一步通過酶聯免疫吸附反應(enzyme-linkedimmunosorbent assays ELISAs)定量檢測總共501例來自兩個臨床醫(yī)

7、學中心包含445位不同受試人群的血清樣本（包括肝癌、乙肝肝硬化、肝良性占位、消化道惡性腫瘤和正常人群），結合受試者血清AFP、腫瘤大小和巴塞羅那分期(BCLC)，分析血清MDK診斷肝癌特別是AFP陰性肝癌和早期肝癌的敏感性和特異性。
　　結果:免疫組化結果顯示，癌組織中MDK表達水平顯著高于癌旁及肝硬化無瘤組織(P＜0.0001)。與對照組(n=193)相比，測試組HCC(n=84)人群的血清MDK水平(1.346 ng/ml;0

8、.864-1.802)明顯升高(P=0.0001);且血清MDK和AFP的受試者工作曲線下面積(AUROC)分別為:0.87和0.69，前者顯著高于后者(P＜0.000)。在另外一套由163例肝細胞癌患者構成的獨立大樣本驗證隊列中(cohort C)，以0.752ng/ml作為MDK的診斷閾值，其診斷HCC的敏感性顯著高于血清AFP(20ng/ml)(83.3％ vs51.2％)，而特異性與AFP相近(81.1％ vs76.7％);即便

9、是在AFP陰性(＜20 ng/ml)肝癌患者中，其敏感性仍可高達82.9％。另外，在診斷早期(BCLC O/A)肝癌患者方面，血清MDK的敏感性(82.3％)亦顯著高于AFP(45.2％)。甚至在20例極早期(BCLC O)肝癌患者中，血清MDK的診斷敏感性為AFP的兩倍(76.2％ vs38.1％)，而且兩者聯合檢測能進一步提高極早期肝癌患者的檢出率到90％。通過研究患者手術前后及復發(fā)前后配對血清MDK水平的變化，發(fā)現患者手術后血清M

10、DK明顯下降(從術前的1.362±0.362ng/ml降至術后的0.482±0.281ng/ml; P＜0.001)，而且隨訪發(fā)現，MDK的水平隨著患者術后的復發(fā)重新升高。
　　結論:血清MDK在肝癌、包括AFP陰性肝癌和早期/極早期肝癌患者中顯著升高，可能成為超越AFP的肝癌早期診斷和復發(fā)監(jiān)測新指標。
　　第二部分高爾基體Ⅱ型膜蛋白(GOLPH2)空間調控表皮生長因子受體(EGFR)內吞/循環(huán)促進肝癌轉移
　　目的:

11、對前期通過激光捕獲顯微切割和基因表達譜芯片發(fā)現的與肝癌轉移密切相關的候選基因GOLPH2進行重點研究，明確其在肝癌轉移進程中的重要作用及其關鍵調控環(huán)節(jié)，探討其作為肝癌轉移分子干預靶點的可行性。
　　方法:運用實時熒光定量PCR技術檢測肝癌及其癌旁組織、正常肝組織、高低轉移潛能的人肝癌細胞系中GOLPH2的mRNA表達水平，比較分析其表達水平與肝癌轉移潛能的關系。進一步通過組織芯片免疫組化染色檢測另外一套獨立肝癌樣本中GOLPH2表

12、達及其與肝癌患者預后的相關性。通過慢病毒介導的RNA干擾/過表達技術及體內外細胞功能試驗，驗證GOLPH2在肝癌侵襲轉移進程中的重要作用。為了進一步研究GOLPH2促進肝癌轉移的分子機制，我們還運用IP-PULL DOWN串聯質譜分析尋找與GOLPH2可能相互作用的蛋白，并進一步利用免疫共沉淀和激光共聚焦共定位驗證相互作用的靶蛋白。最后采用生物素標記的細胞膜分離純化技術、活細胞分子動態(tài)顯像技術和Western-blot等技術探討GOLP

13、H2調節(jié)EGFR內吞循環(huán)促進肝癌轉移的分子機制。
　　結果:RT-PCR結果顯示，與癌旁組織和正常肝組織相比，肝癌組織中GOLPH2 mRNA表達明顯上調（P＜0.0001），伴轉移肝癌組織中GOLPH2表達較無轉移肝癌顯著增高(P＜0.05)，特別在肝癌肝外轉移人群中表達更高（P＜0.01）。在高轉移潛能細胞系中GOLPH2的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于低轉移潛能肝癌細胞株。免疫組化檢測結果顯示，GOLPH2主要表達于腫瘤組

14、織中，其表達水平的高低與患者的預后相關。GOLPH2低表達患者的至復發(fā)時間(TTR)及總體生存(OS)顯著高于GOLPH2高表達患者（TTR:P=0.019;OS:P=0.007）。多因素分析結果也提示GOLPH2是一個影響肝癌預后的獨立因素（P=-0.023）。細胞體內和體外基因Gainand loss研究證實GOLPH2是一個促進肝癌增殖和轉移的原癌基因。通過篩選GOLPH2相互作用蛋白發(fā)現GOLPH2作為一種主要定位于反式高爾基體