1、原發(fā)性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)(簡稱肝癌)是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤死因第三位、我國惡性腫瘤死因第二位(世界半數(shù)以上病例發(fā)生在我國)。雖然部分肝癌病人經(jīng)過早期、積極、綜合治療獲得長期生存，但腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為進(jìn)一步提高肝癌治療效果的最主要障礙。研究表明肝癌根治性切除后5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)60％。目前臨床的主要困擾在于無法早期預(yù)測(cè)哪些病人會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，更無有效防治措施，其

2、關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)移機(jī)理不清。如能探明肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理及其關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，將有助于早期識(shí)別或預(yù)測(cè)哪些病人易于轉(zhuǎn)移，有助于探索有效的干預(yù)措施和治療手段，以進(jìn)一步提高肝癌治療效果、延長病人生存。
　　我所前期工作中，通過比較40例伴與不伴肝內(nèi)轉(zhuǎn)移肝癌間、肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)瘤間基因表達(dá)譜的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌原發(fā)瘤與其肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶基因表達(dá)譜非常相似，而伴與不伴轉(zhuǎn)移肝癌原發(fā)瘤基因表達(dá)譜差異非常明顯，在9180個(gè)基因中153個(gè)基因表達(dá)差異有顯著性(p

3、<0.001)，據(jù)此課題組在國際上首次提出促使肝癌轉(zhuǎn)移的基因改變發(fā)生在原發(fā)腫瘤階段的新觀點(diǎn)(YeQH，etal.NatMed2003)，為肝癌轉(zhuǎn)移早期預(yù)測(cè)和及時(shí)防治提供了可能的理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用激光捕獲顯微切割(LCM)、基因表達(dá)譜芯片和SNP芯片等技術(shù)研究肝癌肝外轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)瘤之間以及有和無肝外轉(zhuǎn)移肝癌原發(fā)瘤之間基因變化的差異，對(duì)前期工作中提出的促使肝癌轉(zhuǎn)移基因改變發(fā)生在原發(fā)瘤階段的新觀點(diǎn)進(jìn)行了深入驗(yàn)證。同時(shí)還篩選出一些

4、可能在肝癌肝外轉(zhuǎn)移進(jìn)程中起重要作用的候選基因，可能為肝癌轉(zhuǎn)移早期預(yù)測(cè)和及時(shí)干預(yù)提供重要靶標(biāo)。其中高爾基體膜相關(guān)蛋白(typeⅡGolgimembraneprotein，GOLPH2，又稱GP73)是表達(dá)差異最顯著的一個(gè)分子。
　　文獻(xiàn)報(bào)道稱GOLPH2在肝癌患者血清中表達(dá)水平升高，可能成為HCC的一個(gè)血清學(xué)指標(biāo)，但其在HCC發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用尚未見報(bào)道。本課題擬在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證GOLPH2基因(GOLM1)在不同

5、肝臟及肝腫瘤組織中的表達(dá)情況，并用免疫組織化學(xué)方法分析其在肝癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系；同時(shí)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定的GOLPH2沉默表達(dá)肝癌細(xì)胞株，觀察肝癌細(xì)胞生長和侵襲等生物學(xué)行為的改變，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法
　　用RT-PCR方法驗(yàn)證基因GOLM1在137例不同正常肝組織、癌胖組織及肝癌(20例伴肝外轉(zhuǎn)移HCC組織、41例肝內(nèi)轉(zhuǎn)移HCC組織、29例無轉(zhuǎn)移HCC組織、36例HCE癌旁

6、組織、11例正常肝組織)組織中的表達(dá)情況，同時(shí)運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)GOLPH2在一套獨(dú)立的組織芯片(包括102例HCC肝癌組織、17例正常肝組織)中的表達(dá)情況，分析GOLPH2蛋白表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA抑制GOLM1表達(dá)，獲得穩(wěn)定的GOLM1低表達(dá)的MHCC97H細(xì)胞株，應(yīng)用RT-PCR及western-blot方法驗(yàn)證干擾效果；并進(jìn)一步觀察穩(wěn)定干擾后細(xì)胞株的生物學(xué)行為的改變(增殖及克隆能力等)。

7、r>　　結(jié)果
　　RT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織和正常肝組織相比，肝癌組織中GOLM1mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.0001)，而伴轉(zhuǎn)移肝癌組織中GOLM1表達(dá)較無轉(zhuǎn)移肝癌顯著增高(P<0.05)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，GOL2H2主要表達(dá)于腫瘤組織中，在癌旁有部分人群呈中低度表達(dá)，而在正常肝組織中幾乎無表達(dá)。GOLPH2低表達(dá)患者的至復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR)及總體生存(OS)顯著好于GOLPH2高表達(dá)患者(TTR：P=0.019；O

8、S：P=0.007)。多因素分析結(jié)果也提示GOLPH2是一個(gè)影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立因素(P=0.023)，可以用于預(yù)測(cè)肝癌患者的復(fù)發(fā)及總體生存。通過慢病毒介導(dǎo)的體系，我們篩選得到穩(wěn)定感染細(xì)胞株MHCC97H-Lenti.GOLM1i-1、MHCC97H-Lenti.GOLM1i-3、MHCC97H-Lenti.GOLM1i-2、MHCC97H-Lenti.GOLM1i-4、MHCC97H-Lenti.GOLM1i-5M。Real-TimeP

9、CR結(jié)果顯示各組GOLM1抑制率分別為Lenti.GOLM1i-1(G1)81.05％、Lenti.GOLM1i-2(G2)36.22％、Lenti.GOLM1i-3(G3)84.61％、Lenti.GOLM1i-4(G4)9.25％、Lenti.GOLM1i-5M(SCR)10.75％，Westernblot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，各組細(xì)胞GOLPH2蛋白的表達(dá)有顯著差異。穩(wěn)定干擾后的97H肝癌細(xì)胞珠體外增殖能力及克隆形成能力均受明顯