1、目的：母胎免疫耐受模型——自然界中我們可以借鑒的一個天然的移植免疫耐受模型.由于正常妊娠與移植耐受機制有一定的相似性，而小鼠在妊娠期間調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量有明顯的增加，功能也具有一定的特殊性，本實驗通過分離純化孕鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞(以下簡稱piTreg)，在體外刺激高純度piTreg的擴增；并驗證piTreg擴增后表達上的變化.此外，采用細胞共培養(yǎng)抑制試驗的方法，以期初步評價Treg、piTreg和ex-Treg(體外擴增后Treg)對n

2、ave T細胞增殖抑制率的區(qū)別。
　　 方法：采用清潔級健康雌性小鼠C57/BL6(H2Kb)，雄性小鼠BALB/c(H2Kd)，體重均為18～23g.將C57/BL6雌性小鼠與BALB/c雄性小鼠同籠受孕。在孕0、7、12、16、20天數(shù)處死母鼠，并取少量非孕鼠做對照，提取脾臟單個核細胞.用流式儀分析孕不同時間piTreg在單個核細胞中的表達情況，確定piTreg(Treg)表達的動態(tài)變化；以及FoxP3在piTreg中的表

3、達情況.用流式細胞分選儀分選piTreg(Treg)，確保純度在90％以上.再將含高濃度的thIL-2和anti-CD3/CD28的擴增培養(yǎng)基，刺激分選后的Treg. piTreg. Naive T細胞和CD4+CD25-T細胞增殖，比較擴增情況；另將nalveT細胞進行CFSE染色，觀察激活后T細胞增長規(guī)律。將分選獲得的高純度piTreg、Treg細胞和ex-Treg作為抑制細胞，分別與CFSE染色的效應細胞(nalve T細胞)和刺

4、激細胞(CD4-T細胞)進行共培養(yǎng)，用ModFit軟件分析效應細胞增殖指數(shù)，以比較各組抑制細胞的抑制效率。統(tǒng)計分析用SPSS16.0統(tǒng)計軟件完成。
　　 結(jié)果：小鼠Treg占脾臟單個核細胞的1～2％，而piTreg占脾臟單個核細胞的比例>2％；piTreg中FoxP3約90％呈陽性.孕不同時期piTreg/CD4+T比例分別為：Od:5.27％，7d:7.79％，10d:17.70％，12d:22.99％，18d:16.88％

5、.流式細胞分選儀分選后，目的細胞純度可提高至95％以上。將分選獲得Treg、piTreg、nalveT細胞和CD4+CD25-T細胞，在含有thIL-2和anti-CD3/CD28的特殊培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)，Treg和piTreg每2～3天增加l倍；而NalveT細胞和CD4+CD25-T細胞每2天增加2倍。CFSE熒光標記nave T細胞后擴增48h，流式分析可見：熒光強度隨著細胞分裂逐代遞減，通過ModFit軟件分析，效應細胞(n

6、aveT細胞)與刺激細胞擴增培養(yǎng)3天后，nalve T細胞的增殖指數(shù)(PI)達20；而Treg、ex- Treg(expanded-Treg)及piTreg以1：1培養(yǎng)時，PI分別為：13.6、15.2、9.6。不同抑制細胞Treg、Treg/10、piTreg、ex-Treg對效應細胞的抑制率分別為0.37±07、0.05±.01、0.53±.01、0.24。piTreg的抑制效應最強。
　　 結(jié)論：⑴妊娠期小鼠體內(nèi)piTr

7、eg會得到擴增，piTreg/CD4+T的比值隨著孕期呈動態(tài)變化，孕中后期較高。⑵流式分選能將Treg(piTreg)純度提高到95％以上，適宜于擴增。高濃度的thIL-2和anti-CD3/CD28能對T細胞進行有效擴增，但piTreg(Treg)的擴增效率較低，2倍/周.T細胞激活后能維持這種活化的狀態(tài)，持續(xù)增殖。⑶nalve T細胞擴增3d后，增殖指數(shù)(PI)可達20。piTreg與naive T共培養(yǎng)后，PI僅為8.8，有明顯的