1、血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由各種腦血管病引起的獲得性智能及認(rèn)知功能損害綜合征，屬神經(jīng)內(nèi)科的常見病、多發(fā)病。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化技術(shù)、原位雜交技術(shù)對(duì)VD小鼠海馬細(xì)胞的ERK、JNK、p38 MAPK的表達(dá)進(jìn)行測定，并將各組跳臺(tái)試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)的學(xué)習(xí)、記憶成績與海馬細(xì)胞的ERK、JNK、p38 MAPK的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果證明了正常組、假手術(shù)組無論是學(xué)習(xí)、記憶成績或是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均與VD模

2、型組小鼠有顯著性差異，VD模型組小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能減退，JNK，p38 MAPK增加，兩者成正相關(guān)，而ERK降低，成負(fù)相關(guān)，證明了MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了小鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能的機(jī)制。而多奈哌齊的應(yīng)用可以通過減少JNK，p38 MAPK增加，增加ERK的表達(dá)改善VD小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能。 本實(shí)驗(yàn)的目的是進(jìn)一步探討VD小鼠ERP的變化、MAPK家族在VD發(fā)病中的表達(dá)的變化及其機(jī)制，多奈哌齊對(duì)其影響。 一、VD小鼠模型的建立及

3、VD小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績的測試 方法： 1.動(dòng)物分組與模型制備：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用3月齡雄性昆明小鼠306只，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2003-1-003，清潔級(jí)2級(jí)，體重(32.5±2.5)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=78)、假手術(shù)組(n=77)、VD模型組(n=75)、多奈哌齊組(n=76)。采用頸總動(dòng)脈線結(jié)反復(fù)缺血再灌注法制備模型，假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎，

4、且尾部不放血。多奈哌齊組為制備模型術(shù)后第2天，給予鹽酸多奈哌齊灌胃，劑量3mg·kg-1·d-1，每天1次。同時(shí)模型組、假手術(shù)組給予生理鹽水，劑量0.01ml·kg-1·d-1，每天1次。 2.學(xué)習(xí)、記憶成績測試：術(shù)后第29天，分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)。測試跳臺(tái)試驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/5min)作為學(xué)習(xí)、記憶成績,水迷宮試驗(yàn)游完全程時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/3min)作為學(xué)習(xí)、記憶成績

5、。術(shù)后第30天，進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)，測試跳臺(tái)試驗(yàn)，潛伏時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)作為記憶成績，水迷宮試驗(yàn)游完全程時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)作為記憶成績。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)采用頸總動(dòng)脈線結(jié)反復(fù)缺血再灌注法成功地制備了小鼠VD模型,經(jīng)跳臺(tái)試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了VD小鼠存在學(xué)習(xí)和記憶功能障礙,VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的學(xué)習(xí)、記憶成績低于正常組、假手術(shù)組,記憶階段的記憶成績亦低于正常組、假手術(shù)組.多奈哌齊可改善學(xué)習(xí)階段、記憶階段的學(xué)習(xí)、記憶成績。 二、

6、VD小鼠ERP測定與評(píng)價(jià)及多奈哌齊的影響 方法: 1.動(dòng)物分組與模型制備:將64例小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=16)、假手術(shù)組(n=16)、VD模型組(n=16)、多奈哌齊組(n=16).采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈線結(jié)反復(fù)缺血再灌注法制備VD小鼠模型.利用跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)觀測其行為學(xué)改變。 2.ERP電位測定方法:將小鼠固定在立體定位儀(自制)上,剃除耳后、頭頂部及額部毛,75％酒精消毒皮膚,用0.5寸毫針刺入至矢狀縫

7、與兩外耳道連線交點(diǎn)頭皮下,斜向前約2～3mm,作為記錄電極；參考電極置于耳后下方；接地電極置于前額部.采用加拿大Xltek公司生產(chǎn)的肌電圖誘發(fā)電位測定儀,實(shí)驗(yàn)采用短聲刺激,靶刺激頻率2000Hz,概率20％；非靶刺激頻率1000Hz,概率80％.刺激聲強(qiáng)120dB,分析時(shí)間500ms,疊加300次,并顯示N2潛伏期、P3潛伏期及波幅等,測定重復(fù)3次,取平均值。 結(jié)論: 建立了小鼠在非麻醉狀態(tài)下采取頭部皮下插入電極測定ERP的方法

8、,為動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究提供了客觀的、無創(chuàng)性的、定量的、有價(jià)值的電生理檢測手段。證實(shí)VD模型組小鼠N2潛伏期、P3潛伏期明顯長于正常組、假手術(shù)對(duì)照組,P3波幅明顯低于正常組、假手術(shù)對(duì)照組。多奈哌齊組可減低小鼠的N2潛伏期、P3潛伏期,提高P3波幅。 三、VD小鼠海馬神經(jīng)元JNK及其JNK mRNA的變化及多奈哌齊的影響 方法: 1.動(dòng)物分組與模型制備:將87例小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=23)、假手術(shù)組(n=21)、V

9、D模型組(n=22)、多奈哌齊組(n=21).采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈線結(jié)反復(fù)缺血再灌注法制備VD小鼠模型.利用跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)觀測其行為學(xué)改變。 2.JNK測定方法:小鼠以10％水合氯醛麻醉,經(jīng)灌注固定其腦組織,海馬組織部位常規(guī)石蠟切片,應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)技術(shù)觀察海馬CA1區(qū)JNK陽性錐體細(xì)胞的形態(tài)和分布,計(jì)算各切片海馬CA1區(qū)JNK染色陽性錐體細(xì)胞相同面積數(shù)目,應(yīng)用原位雜交(in

10、 situ hybridization,ISH)技術(shù)方法測定各組小鼠海馬CA1區(qū)JNK mRNA表達(dá)陽性錐體細(xì)胞的變化。 結(jié)論: VD小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績下降可能與其海馬JNK陽性錐體細(xì)胞水平增加有關(guān).JNK陽性錐體細(xì)胞的增加是血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績下降的分子學(xué)機(jī)制之一.多奈哌齊可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)JNK陽性錐體細(xì)胞水平的上升,促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績的改善。 四、VD小鼠海馬神經(jīng)元ERK1及其ERK1mRNA的

11、變化及多奈哌齊的影響 方法: 1. 動(dòng)物分組與模型制備:將91例小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=23)、假手術(shù)組(n=24)、VD模型組(n=21)、多奈哌齊組(n=23)).采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈線結(jié)反復(fù)缺血再灌注法制備VD小鼠模型.利用跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)觀測其行為學(xué)改變。 2. ERK1測定方法:小鼠以10％水合氯醛麻醉,經(jīng)灌注固定其腦組織,海馬組織部位常規(guī)石蠟切片,應(yīng)用IHC技術(shù)觀察海馬CA1區(qū)ERK1陽性錐體細(xì)胞

12、的形態(tài)和分布,計(jì)算各切片海馬CA1區(qū)ERK1染色陽性錐體細(xì)胞面密度值,應(yīng)用ISH技術(shù)方法測定各組小鼠海馬CA1區(qū)ERK1mRNA表達(dá)陽性細(xì)胞的變化。 結(jié)論: 證實(shí)了海馬組織ERK1的減少與血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績下降有關(guān),多奈哌齊可以通過促進(jìn)海馬ERK1水平的上升,改善VD的學(xué)習(xí)、記憶成績。 五、VD小鼠海馬神經(jīng)元p38 MAPK及其p38 MAPK mRNA的變化及多奈哌齊的影響 方法: 1.動(dòng)物分

13、組與模型制備:將64例小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=16)、假手術(shù)組(n=16)、VD模型組(n=16)、多奈哌齊組(n=16).采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈線結(jié)反復(fù)缺血再灌注法制備VD小鼠模型.利用跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)觀測其行為學(xué)改變。 2.p38 MAPK測定:小鼠以10％水合氯醛麻醉,經(jīng)灌注固定其腦組織,海馬組織部位常規(guī)石蠟切片,應(yīng)用IHC技術(shù)觀察海馬CA1區(qū)p38 MAPK陽性錐體細(xì)胞的形態(tài)和分布,計(jì)算各切片海馬CA1區(qū)p38 MAP