1、巨噬細胞抑制因子(Macrophage-inhibitoryfactor，MIF)是最早被闡述的細胞因子之一，已有的研究表明，MIF高表達是引起膿毒癥、糖皮質(zhì)激素拮抗、類風濕性關節(jié)炎、腫瘤的等病理過程的主要原因。有研究者以抗MIF單克隆抗體處理膿毒癥小鼠，發(fā)現(xiàn)可顯著提高其存活率，提示阻斷MIF的作用可抑制MIF高表達所引起的病理過程。但MIF保守性較高，抗體制備困難；且抗體進入臨床應用，人源化問題是一大障礙。近期研究發(fā)現(xiàn)，CD74(MH

2、CⅡ恒定鏈輔助分子)胞外區(qū)73-232aa(sCD74)是MIF的天然受體，阻斷MIF與CD74的結合可以阻斷由MIF介導的信號通路。MIF受體的發(fā)現(xiàn)，為抑制MIF高表達提供一種新的選擇--受體競爭。DNA改組技術是一種簡單高效的蛋白質(zhì)體外進化技術，已有許多分子通過DNA改組具有了更高的親和力、更高的催化活性或更好的穩(wěn)定性。本研究擬利用DNA改組技術(DNAshuffling)對sCD74基因進行改組，結合T7噬菌體表面展示技術(T7p

3、hagedisplay)，篩選一株高親和力結合MIF的突變體，并進行初步鑒定，為尋找一種具有潛在臨床治療前景的MIF抑制劑奠定基礎。 主要研究內(nèi)容和結果： 1.sCD74的原核表達與驗證 (1)sCD74-pQE-80L重組載體的構建、原核表達與純化：以Genebank查詢的人CD74mRNA序列(BT019505)為模板，設計分別含有BamHⅠ、SalⅠ限制性酶切位點的上、下游特異性引物，從人外周血白細胞cDN

4、A克隆sCD74基因；目的片段純化后經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ限制性雙酶切，連接pQE-80L載體，經(jīng)限制性酶切鑒定后送Ivitrogen公司進行測序分析；將測序正確的重組sCD74-pQE-80L質(zhì)粒轉化M15感受態(tài)細菌進行誘導表達；細菌經(jīng)超聲波破碎，離心取上清進行His親和層析純化，分梯度洗脫，收集各洗脫成分進行SDS-PAGE分析。通過上述實驗克隆得到了人sCD74基因，原核表達產(chǎn)物His親和純化后純度經(jīng)SDS-PAGE測定約為95％

5、。 (2)sCD74與MIF結合的驗證：采用半干轉法將純化的重組sCD74轉移至PVDF膜，以鼠抗人CD74單克隆抗體(LN-2)及羊抗鼠IgG進行westernblot分析，化學發(fā)光法檢測結果；將MIF包被96孔ELISA平板，加入不同濃度重組sCD74，以鼠抗人CD74單克隆抗體(LN-2)及羊抗鼠IgG孵育后加OPD顯色，450nm測定OD值。原核表達sCD74經(jīng)westernblot驗證正確；ELISA實驗表明倍比稀釋s

6、CD74與MIF結合呈線性，R2=0.9925，證明了MIF與CD74結合的報道。 2.DNAshuffling改組sCD74基因 (1)人、小鼠、牛sCD74同源基因的克隆：對人、小鼠(NM_010545)、牛(BT021489)CD74cDNA序列進行生物信息學分析，確定人、小鼠、牛sCD74同源區(qū)，設計特異性引物從外周血白細胞cDNA模板克隆sCD74同源區(qū)DNA片段；將克隆得到三種同源基因DNA片段連接prome

7、ga公司的pGEM-T載體，進行藍白斑篩選，然后將經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割鑒定的陽性克隆送Invitrogen公司進行測序分析。測序結果顯示克隆得到的人、小鼠、牛sCD74基因片段正確。 (2)人、小鼠、牛sCD74同源基因的定點突變：設計定點突變引物，采用交錯延伸PCR將人、小鼠、牛sCD74同源基因內(nèi)部的HindⅢ酶切位點(AAgCTT)突變?yōu)锳AgCTg，突變產(chǎn)物連接promega公司pGEM-T載體，轉化DH5α感受態(tài)進行藍白

8、斑篩選，然后將經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割鑒定的陽性克隆送Ivitrogen公司進行測序分析。測序結果顯示人、小鼠、牛sCD74基因內(nèi)部HindⅢ酶切位點已被定點突變?yōu)锳AgCTg。 (3)隨機小片段DNA的制備：將人、小鼠、牛同源sCD74DNA片段按等摩爾比混合，以DNaseⅠ37℃消化30min，以2.0％瓊脂糖凝膠電泳分析消化產(chǎn)物，切下30-50bp大小的DNA片段，以B型小片段DNA高效回收試劑盒(博大泰克公司)回收。

9、(4)DNAshuffling：首先進行無引物PCR，將回收的隨機小片段DNA加入200μl微量離心管，加入dNTP、taq酶及緩沖液、Mg2+等，以ddH2O補足至20μl，反應20個循環(huán)，以2.0％瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物：向無引物PCR產(chǎn)物管中加入分別含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點的上、下游特異性引物，并按50μl體系補加dNTP、taq酶及緩沖液、Mg2+等，反應15個循環(huán)，以1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，將500bp左右片

10、段切下回收。 3.T7噬菌體展示文庫的構建與篩選 (1)T7噬菌體展示文庫的構建：將回收的500bp大小DNA片段以EcoRⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶切割，回收后以3:1摩爾比與T7Select()10-3bCloningKit(Novagen)試劑盒提供的T7Select10-3EcoRⅠ/HindⅢVectorArm16℃連接過夜；將5μl連接產(chǎn)物與25μlT7Select()biopanningkit(Novage

11、n)試劑盒提供的T7packagingextracts混合組裝噬菌體(2平行管)；取5μl組裝產(chǎn)物測定噬菌體文庫原始容量。經(jīng)測定，組裝得到了一個容量為2.1×107pfu的突變體原始文庫。 (2)淘洗法篩選高親和力突變體噬菌體：將MIF以0.5μg/孔包被96孔ELISA平板，封閉后將原始噬菌體加入96孔板(2復孔)，室溫作用30min后棄去孔內(nèi)液體，以TBST洗滌3次，加洗脫液洗脫孔內(nèi)結合的噬菌體，感染BLT5403宿主菌，擴

12、增至OD600開始下降時止，測定擴增前后噬菌體滴度(pfu)；以重組sCD74封閉MIF后再加入噬菌體，逐步縮短突變體噬菌體與MIF作用的時間，同時逐步提高洗滌力度，延長洗脫時間，再進行3輪淘洗。經(jīng)過四輪淘洗，噬菌體得到有效富集，第四輪淘洗克隆數(shù)為200，富集值為3.3×10-5。 (3)高親和力突變體噬菌體的鑒定：建立第四輪淘洗上清的噬菌體平板，選取噬菌斑數(shù)目約100個/板的平板，隨機挑取40個單克隆，擴增后進行PCR鑒定陽性

13、率；取PCR陽性的噬菌體與原核表達sCD74，以競爭ELISA測定單克隆突變體噬菌體抑制sCD74結合MIF的效果，PCR克隆3株高親和力株所含的插入片段，送Ivitrogen公司測序。競爭性ELISA分析顯示，高親和力突變體噬菌體PHCD74mu具有體外抑制sCD74與MIF結合的作用(p＜0.01)，且噬菌體與MIF的結合呈線性(R2=0.9905)；隨機挑取的3個單克隆測序分析顯示為相同克隆，命名此突變體為HCD74mu，是一個3

14、1氨基酸長度的短肽。 4.高親和力sCD74突變體(HCD74mu)的原核表達、純化與鑒定 (1)HCD74mu-pET42a表達載體的構建：以分別含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點的上、下游引物克隆HCD74mu編碼基因，雙酶切后連接pET42a載體，轉化E.coliBL21，將PCR鑒定陽性的單克隆送Ivitrogen公司測序。測序結果顯示，克隆正確。 (2)HCD74mu的原核表達與純化：將測序正確的HCD

15、74mu-pET42a質(zhì)粒轉化BL21感受態(tài)細菌進行誘導表達，離心收集細菌進行超聲破碎，離心取上清進行GST親和層析純化，以SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物。SDS-PAGE顯示產(chǎn)物純度約為95％。 (3)競爭性ELISA鑒定重組HCD74mu抑制sCD74與MIF結合的效果：將MIF包被96孔ELISA平板，以競爭ELISA測定重組表達HCD74mu抑制sCD74結合MIF的效果。結果顯示，重組HCD74mu具有顯著的體外競爭性抑

16、制sCD74與MIF結合的作用(p＜0.01)，且不同濃度HCD74mu與MIF結合呈線性(R2=0.9969)。 結論： 本研究以人、小鼠、牛CD74胞外同源區(qū)基因為模板，組合利用DNA改組技術及T7噬菌體展示技術，構建了改組人sCD74T7噬菌體展示文庫，經(jīng)過四輪篩選得到了一株高親和力結合MIF的突變體HCD74mu；構建了HCD74mu的原核表達載體，誘導表達并進行了GST親和層析純化；經(jīng)競爭性ELISA驗證，HC