1、本課題的研究，有助于進(jìn)一步闡明PDGF-BB及其受體PDGFR-β在創(chuàng)面愈合中的作用和調(diào)控機(jī)制，以及是否通過(guò)MMP-9這一靶點(diǎn)促進(jìn)創(chuàng)面愈合，為PDGF-BB促進(jìn)創(chuàng)面愈合提出可能的機(jī)制。同時(shí)，還探討了中藥丹皮酚對(duì)這些靶點(diǎn)的調(diào)控作用，為尋找促進(jìn)創(chuàng)面愈合的藥物提供的了新的思路。 第一部分 PDGF-β受體在人真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及藥物作用研究 1．建立了人真皮成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，用MTT法考察了丹皮酚對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞生

2、存性的影響。 2．RT-PCR法證實(shí)，在人真皮成纖維細(xì)胞中存在PDGFR-β mRNA表達(dá)，10μg·L-1TNF-α可顯著上調(diào)PDGFR-β mRNA的表達(dá)，丹皮酚能抑制TNF-α引起的PDGFR-β mRNA表達(dá)上調(diào)，且存在良好的劑量關(guān)系。 3．流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)，在人真皮成纖維細(xì)胞膜表面存在PDGFR-β表達(dá)，基礎(chǔ)陽(yáng)性表達(dá)率為28.65±0.06％。10μg·L-1TNF-α刺激成纖維細(xì)胞24h能顯著地上調(diào)細(xì)胞表面

3、PDGFR-β的陽(yáng)性表達(dá)率，此時(shí)的陽(yáng)性表達(dá)率為41.13±5.30％。單獨(dú)使用100mg·L-1 Pae刺激成纖維細(xì)胞24h后，PDGFR-β在人真皮成纖維細(xì)胞上陽(yáng)性表達(dá)率可顯著上調(diào)至37.35±0.31％。當(dāng)使用10μg．L-1TNF-α與不同濃度(10、50、100 mg·L-1)Pae共刺激時(shí)，PDGFR-β陽(yáng)性表達(dá)率分別為41.10±1.29％，39.96±0.91％，33.32±0.95％，結(jié)果與僅加10μg·L-1TNF-α

4、相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明，在TNF-α模擬的創(chuàng)面難愈內(nèi)環(huán)境中，PDGFR-β mRNA的表達(dá)量和受體在細(xì)胞表面的陽(yáng)性表達(dá)率顯著上調(diào)，受體數(shù)目的上調(diào)能夠增強(qiáng)PDGF-BB效應(yīng)，更大程度的發(fā)揮配體促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移增殖等作用，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。 第二部分 MMP-9在人真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及藥物作用研究 1．RT-PCR結(jié)果表明，MMP-9 mRNA在人真皮成纖維細(xì)胞中表達(dá)極弱或基本不表達(dá)。TNF-α可以誘導(dǎo)MMP-9

5、 mRNA的表達(dá)，使其上調(diào)。TNF-α與不同濃度的Pae共孵育，Pae可以顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)引起的MMP-9 mRNA表達(dá)的上調(diào)，且呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。 2．Western blotting結(jié)果顯示，MMP-9在正常人真皮成纖維細(xì)胞中表達(dá)很弱，10μg·L-1TNF-α可使MMP-9表達(dá)顯著上調(diào)。當(dāng)TNF-α與不同濃度(10、50、100 mg· L-1)的Pae共孵育時(shí)，MMP-9的蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)，分別下調(diào)8.77

6、％、14.04％和10.53％。 上述結(jié)果表明，在TNF-α，模擬的創(chuàng)面難愈內(nèi)環(huán)境中，MMP-9的表達(dá)量顯著升高，過(guò)高的MMP-9表達(dá)量會(huì)使得ECM過(guò)度降解，延長(zhǎng)創(chuàng)面愈合時(shí)間。 第三部分 PDGF-BB在人真皮成纖維細(xì)胞中對(duì)MMP-9表達(dá)的影響及藥物作用研究 1．Western blotting結(jié)果證實(shí)，MMP-9在正常人真皮成纖維細(xì)胞中表達(dá)較弱，10μg·L-1TNF-α可使MMP-9表達(dá)顯著上調(diào)。當(dāng)使用TNF

7、-α與不同濃度(2、5、10μg·L-1)的PDGF-BB共孵育時(shí)，PDGF-BB能夠顯著抑制TNF-α引起的MMP-9表達(dá)上調(diào)，其中高劑量(10μg·L-1)PDGF-BB能夠?qū)MP-9表達(dá)量極顯著下調(diào)44.68％。100mg·L-1 Pae與10μg·L-1TNF-α?xí)r，也能夠顯著抑制TNF-α引起的MMP-9表達(dá)上調(diào)，使得MMP-9表達(dá)量下調(diào)48.94％。 2．ELISA結(jié)果顯示，正常人真皮成纖維細(xì)胞MMP-9分泌基礎(chǔ)值

8、較低，為2.328±0.005 pg·mL-1，10μg·L-1TNF-α刺激24h后，真皮成纖維細(xì)胞MMP-9分泌量顯著上升至7.371±2.179pg·mL-1。不同濃度(2、5、10μg·L-1)PDGF-BB與TNF-α共孵育均可顯著降低TNF-α引起的MMP-9分泌增加。100 mg·L-1Pae與TNF-α共孵育24h后，MMP-9分泌量也顯著下降至2.325±0.001，接近分泌基礎(chǔ)值。 3．ELISA法檢測(cè)人真皮

9、成纖維細(xì)胞分泌TIMP-1結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞TIMP-1分泌基礎(chǔ)值為12.952±0.3161pg·mL-1，10μg·L-1TNF-α刺激24h后，TIMP-1分泌量上調(diào)35.01％；不同濃度(2、5、10μg·L-1)PDGF-BB與TNF-α共孵育，TIMP-1出現(xiàn)分泌減少現(xiàn)象，100 mg·L-1Pae與TNF-α共孵育24h后，TIMP-1分泌也出現(xiàn)減少現(xiàn)象，分泌量為12.321±1.093pg·mL-1。 4．分析

10、人真皮成纖維細(xì)胞分泌MMP-9/TIMP-1比值得知，正常人真皮成纖維細(xì)胞分泌的MMP-9/TIMP-1基礎(chǔ)值為0.180，10μg·L-1TNF-α作用人真皮成纖維細(xì)胞24h后，比值上升至0.434。用不同濃度(2、5、10μg·L-1)PDGF．BB與TNF-α共孵育后，MMP-9/TIMP-1比值下降，說(shuō)明平衡向MMP-9減少的方向移動(dòng)，10mg·L-1Pae也具有和PDGF-BB相似的效果，能降低TNF-α引起的MMP-9/TI

11、MP-1平衡偏移。 上述結(jié)果表明，在TNF-α模擬的創(chuàng)面難愈內(nèi)環(huán)境中，PDGF-BB能夠顯著降低MMP-9的表達(dá)和分泌，并促使MMP-9/TIMP-1恢復(fù)平衡，這可能是PDGF-BB促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)理之一。100 mg·L-1丹皮酚對(duì)于MMP-9蛋白表達(dá)和分泌的下調(diào)作用與PDGF-BB相似，提示了其在治療創(chuàng)面難愈方面具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。 第四部分 PDGF-BB對(duì)真皮成纖維細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子、趨化因子的影響及藥物作

12、用研究 1．采用ELISA法考察了PDGF-BB及Pae對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞分泌IFN-γ的影響，結(jié)果表明，人真皮成纖維細(xì)胞IFN-γ分泌基礎(chǔ)值為28.704±4.4E．15 pg·mL-1，單獨(dú)使用10μg·L-1PDGF-BB刺激，分泌量下調(diào)12.68％。不同濃度(10、50、100 mg·L-1)的Pae分別與PDGF-BB共孵育后，與對(duì)照組相比，50mg·L-1Pae能顯著增加IFN-γ分泌量。 2．采用ELISA

13、法考察了PDGF-BB及Pae對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞分泌IL-6的影響，人真皮成纖維細(xì)胞IL-6分泌基礎(chǔ)值為193.965±22.634 pg·mL-1；單獨(dú)使用10μg．L-1IPDGF-BB刺激，IL-6分泌值上調(diào)至238.513±11.568 pg·mL-1。不同濃度(10、50、100 mg·L-1)的Pae分別與PDGF-BB共孵育，IL-6分泌值均有顯著下調(diào)。 3．采用ELISA法考察了PDGF-BB及Pae對(duì)人真皮成纖

14、維細(xì)胞分泌IL-8的影響，人真皮成纖維細(xì)胞IL-8分泌基礎(chǔ)值為755.042±34.113 pg·mL-1；單獨(dú)使用101μg·L-1PDGF-BB刺激，IL-8分泌值上調(diào)至1025.120±71.775 pg·mL-1上調(diào)35.77％，Pae與PDGF-BB共孵育，與對(duì)照組相比，IL-8分泌量均有所下調(diào)，其中，10 mg·L-1Pae下調(diào)極為顯著，50、100 mg·L-1Pae分別將IL-8分泌量下調(diào)20.49％和22.73％。