1、目的:本課題旨在建立小鼠后足癌痛模型基礎之上,觀察華蟾素對模型小鼠癌痛行為的影響及外周機制研究,為華蟾素臨床治療癌痛提供理論依據(jù)。
　　方法:實驗一:小鼠癌痛模型的制作:選用體重18～20g雌性昆明小鼠,隨機分為正常組(左足底注射0.1ml生理鹽水)和模型組(左足底注入 H22肝癌細胞懸液0.1ml含腫瘤細胞0.6×107個)。記錄每只小鼠體重及造模前、造模后第2、4、6、8天痛閾值變化,隨后按一定時間處死小鼠取其左后足做 HE染

2、色,進行形態(tài)學觀察。實驗二:局部給予華蟾素對癌痛模型小鼠癌痛行為的影響研究；另取112只雌性昆明小鼠隨機分為對照組16只、造模組96只,待造模成功后小鼠再隨機分為模型組、基質組、嗎啡組及華蟾素腹腔注射組、外用組、瘤周注射組。從造模第9天給藥,連用8天。記錄各組小鼠給藥前、第1次給藥后0.5、1.0、1.5、3、6小時以及給藥后第2、4、6、8天測定的痛閾值。給藥第8天痛行為測定結束后,眼球取血,頸椎脫臼處死動物后,取脾和胸腺并稱重,計算

3、脾和胸腺指數(shù),留取左后足腫瘤病變組織標本。采用ELISA法檢測腫瘤病變組織和血液中CRF、IL-1β和β-END的含量;應用免疫組化檢測腫瘤病變組織中POMC、β-END、μ-OR受體蛋白的表達;采用免疫熒光檢測腫瘤病變組織中CD3+、CD4+、CD8+細胞蛋白的表達。
　　結果:實驗一:小鼠后足癌痛模型的制作:隨著足部腫瘤增大,自主活動降低,期間可見自發(fā)抬足、跛行蜷縮等自發(fā)性痛行為;后足形態(tài)學觀察,左后足癌細胞逐步侵潤最終至骨,

4、足部荷瘤小鼠成瘤率100％。與造模前相比,癌痛模型小鼠熱刺激、機械性痛閾值逐漸降低,造模第2天熱刺激痛閾值降低(P<0.05),第4天熱刺激、機械力痛閾值均明顯降低(P<0.01)。模型組小鼠造模第2、4、6、8天熱刺激、機械力刺激痛閾值較正常組均降低(P<0.01)。實驗結果證實:該癌痛模型制備較為成功,可作為研究癌痛的工具。實驗二:(1)給藥后痛行為測定:第1次給藥,各用藥組給藥0.5、1.0、1.5、3、6小時熱刺激和機械力痛閾值

5、升高(分別與用藥前及模型組比較:P<0.05或P<0.01);連續(xù)給藥8天后,各用藥組給藥后第2、4、6、8天機械力痛閾值升高(與用藥前比較:P<0.01,與模型組比較:P<0.01)。(2)脾和胸腺指數(shù)測定:模型組小鼠脾指數(shù)較正常組顯著降低(P<0.01);各用藥組模型小鼠脾指數(shù)較模型組顯著提高(P<0.01或P<0.05)。胸腺指數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學意義。(3)腫瘤病變組織和血液中IL-1β、CRF、β-END含量測定:①組織中:

6、與正常組比較,模型組腫瘤病變組織中CRF、IL-1β含量顯著增高(P<0.01),β-END含量降低(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,華蟾素瘤周注射組、外用組、腹腔注射組腫瘤病變組織中β-END、CRF含量顯著提高(P<0.05或P<0.01),IL-1β含量降低(P<0.05或P<0.01)。②血液中:與正常組比較,模型組血液CRF、IL-1β含量顯著增高(P<0.01),β-END含量顯著降低(P<0.01);與模型組比

7、較,嗎啡組、華蟾素外用、腹腔注射組血漿β-END含量顯著升高(P<0.01),嗎啡組CRF含量顯著降低(P<0.01),余下用藥組血漿β-END、CRF、血清IL-1β含量差異均無統(tǒng)計學意義。(4)腫瘤病變組織中POMC、β-END、μ-OR受體蛋白表達:免疫組化顯示,模型組腫瘤病變組織POMC、β-END、μ-OR受體表達較正常組顯著下降(P<0.01);與模型組比較,嗎啡組腫瘤病變組織μ-OR受體表達顯著升高(P<0.01),而PO

8、MC、β-END表達差異無統(tǒng)計學意義;其余用藥組POMC、β-END、μ-OR受體表達顯著升高(P<0.01或P<0.05)。(5)腫瘤病變組織中CD3+、CD8+、CD4+細胞蛋白表達:免疫熒光顯示,與模型組比較,華蟾素瘤周注射、外用組CD4+細胞蛋白表達升高(P<0.05或P<0.01),而嗎啡組、華蟾素腹腔注射組差異無統(tǒng)計學意義,華蟾素瘤周注射、外用、腹腔注射組腫瘤病變組織CD3+、CD8+細胞蛋白表達均明顯升高(P<0.01),

9、嗎啡組CD3+、CD8+、CD4+細胞蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義。(6)華蟾素三種給藥方式(瘤周注射、外用涂抹、腹腔注射)兩兩比較主要陽性結果:①痛行為:初次給藥,各組間機械力痛閾值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05),其中華蟾素腹腔組機械力痛閾值升高最明顯,瘤周組其次,外用組再次;華蟾素腹腔注射組初次給藥0.5h熱刺激、機械力痛閾值明顯高于瘤周注射、外用組(P<0.01)。②腫瘤病變組織中:華蟾素瘤周組β-END分別較腹腔

10、組、外用組含量較少(P<0.01)。華蟾素外用組CD4+細胞蛋白分別較瘤周注射、腹腔注射組表達量較低(P<0.01)。華蟾素瘤周注射組CD8+細胞蛋白較腹腔注射組表達較高(P<0.01)。
　　結論:(1)本研究采用H22肝癌細胞制作小鼠足部癌痛模型方法操作簡單易行,成瘤率高,具有熱、機械性痛覺過敏,逐步加重,有患肢抬腳、外翻等自發(fā)性痛行為和“鏡像痛”人類進展性溶骨骨癌的終末表現(xiàn),證實癌痛模型的制作較為成功,為本實驗后續(xù)進行華蟾素

11、抗癌痛的外周作用及機制研究提供了堅實的基礎。(2)華蟾素對模型小鼠癌痛有一定的緩解作用,其機制與提高腫瘤局部病變組織β-END的含量有關,同時華蟾素對 TIL有一定的促進作用。通過華蟾素外用(含基質組)、腹腔注射組佐證進行縱向比較,并進一步將華蟾素的三種給藥方式(瘤周注射、外用涂抹、腹腔注射)進行兩兩比較,檢測指標說明華蟾素鎮(zhèn)痛作用是通過外周局部來發(fā)揮的,但腫瘤局部病變組織β-END是否來自于 TIL(或具體何種類型)本課題組正在通過后