1、髓系是造血系統(tǒng)分化發(fā)育過程中一支重要的譜系，其進一步分化成熟產生單核/巨噬細胞和粒細胞，這兩類細胞是機體固有免疫的主要組成者，是機體實施免疫反應、炎癥反應和創(chuàng)傷修復的重要分子，因此研究這兩類細胞的分化有著重要的生理意義。而目前認為，在細胞因子的作用下，細胞內特定基因的表達或關閉在細胞分化過程中起著主導的地位,其調控異常是造血系統(tǒng)腫瘤發(fā)生啟動因素和治療靶點。因此發(fā)現和深入研究這些基因表達調控的機制有助于認識腫瘤發(fā)生發(fā)展機制,為腫瘤的防治提

2、供重要依據.
　　QKI是一類RNA結合蛋白，由于其上游調控區(qū)的部分缺失引起組織特異性的QKI表達降低導致神經髓鞘發(fā)育障礙，小鼠出生后10天出現嚴重的震顫表型，故命名為QKI（quaking）。它屬于RNA結合蛋白STAR（signalsTransductionsActivatorsofRNAs）家族，此蛋白結構具有結合上游蛋白激酶的SH3結構域，同時又具有RNA結合蛋白的結構特征，具有介導上游蛋白激酶和調控下游基因表達的雙重角色

3、，是重要的功能分子。目前對于它的研究大部分集中在中樞神經系統(tǒng)中。QKI主要通過調控髓鞘形成過程中重要分子，如MBP、MAG等的表達來參與髓鞘的形成。作為RNA結合蛋白，QKI對靶分子的調控主要是通過識別并結合于mRNA3’UTR上的特定序列即QKI反應元件（QRE）來調控其表達。這一調控發(fā)生在mRNA細胞內的定位、mRNA的穩(wěn)定性以及翻譯效率的改變等多個環(huán)節(jié)。
　　除了在神經系統(tǒng)外，QKI還在多種組織和器官中廣泛表達，參與多個系統(tǒng)

4、的發(fā)育和細胞增殖、分化與凋亡。一些ENU誘導的QKI純合突變的小鼠出現胚胎致死表型，目前認為與卵黃囊時期的胚胎造血異常密切相關。在2005年發(fā)表于NatStructMolBio上的一篇文章中預測的眾多QKI靶分子中，有部分與造血系統(tǒng)髓系分化密切相關。因此我們將QKI的研究集中在造血系統(tǒng)髓系的分化與發(fā)育上。
　　首先，我們在白血病細胞HL-60和THP-1的誘導分化模型中發(fā)現，造血系統(tǒng)髓系向單核/巨噬系和粒系分化過程中，QKImRN

5、A和蛋白表達水平均明顯降低，可能與轉錄抑制有關。利用生物信息學分析QKI上游啟動子區(qū)約2000bp，發(fā)現多個調控髓系分化的重要轉錄因子的結合位點；其中轉錄因子C/EBPα的表達水平變化與QKI一致，且QKI的變化發(fā)生在C/EBPα變化之后，提示QKI可能是C/EBPα的下游分子；進一步利用QKI啟動子的熒光素酶報告系統(tǒng)檢測和體內的ChIP實驗進一步證實C/EBPα直接結合于QKI啟動子距起始碼ATG上游約1872bp-2036bp處上調

6、其表達；隨著分化的進程，由于C/EBPα的減少，結合于QKI啟動子的C/EBPα減少，導致表達水平的下降。
　　單核/巨噬細胞分化過程中蛋白表達分析發(fā)現，決定單核/巨噬細胞譜系定向分化的特異性分子單核巨噬細胞集落刺激因子受體CSF1R（Macrophage-colonystimulatingfactorreceptor，M-CSFR,又稱為CSF1R）與QKI的表達趨勢相反；在細胞內干涉或過表達QKI后，CSF1R也出現相反的表達

7、變化，CSF1R是QKI的一個下游分子并受其負調控；在NCBI數據庫中查找并比對不同種屬間CSF1R3’UTR的序列，發(fā)現在人、牛、小鼠和貓之間同源性很高且均含有一個或兩個QKI反應元件；將CSF1R3’UTR構建報告基因同時結合體內的RNA-IP實驗證實QKI直接作用于CSF1R3’UTR降低其mRNA的穩(wěn)定性而負調控CSF1R的表達。由此證實，在單核/巨噬細胞分化過程中，QKI表達水平的降低解除了對CSF1RmRNA的降解，使其表達

8、水平升高，接受配體M-CSF信號的刺激，促使前體細胞一步步向單核/巨噬細胞分化。
　　粒細胞分化模型中發(fā)現，在10％血清條件下，ATRA誘導HL-60細胞不完全分化，以細胞周期阻滯為主要效應時，QKI表達無明顯變化；在2％血清條件下，ATRA誘導絕大部分細胞分化為成熟的粒細胞，QKI在mRNA和蛋白水平均明顯降低；改用另一較強的誘導分化劑DMSO，使大部分細胞快速分化為成熟的粒細胞時，QKI在mRNA和蛋白水平出現明顯迅速的降低。

9、由此看出，QKI的降低速度和程度與細胞分化的速度與程度呈正比；在這一過程中，QKI與C/EBPα的變化一致，因此QKI的降低與C/EBPα調控的減弱有關。另外，在粒系分化過程中，轉入siRNA加速內源QKI的降低，細胞核形態(tài)檢測發(fā)現前體細胞立即分化為成熟的粒細胞。由此初步得出結論，QKI在粒細胞的終末分化和活化中發(fā)揮重要調控作用。深入的機理研究正在進行當中。
　　此外，為了在血液細胞中實現QKI過表達來進行深入的功能研究，我們還構

10、建和包裝了過表達QKI的慢病毒，目前已能夠成功感染貼壁細胞并實現穩(wěn)定過表達QKI。
　　通過本課題的研究，首先，我們加深了對造血系統(tǒng)髓系分化的認識，首次提出RNA結合蛋白在這一過程中發(fā)揮重要作用。它不僅是受髓系分化重要轉錄因子C/EBPα直接調控的一個新的靶分子，還能夠直接對細胞因子受體CSF1R進行轉錄后調控，決定單核/巨噬細胞能否正常分化；其次，進一步認識了轉錄后調控機制，發(fā)現了QKI新的功能和作用機制；再次，鑒于C/EBPα