1、動脈粥樣硬化為嚴重危害公眾健康的常見病和多發(fā)病，是致殘和致死率高的冠心病和腦卒中的病理學基礎之一。炎癥反應學說是當今最主要的動脈粥樣硬化學說之一。該學說與脂質浸潤學說相輔相成，其基礎是損傷反應學說，被免疫學說所拓展。損傷反應學說強調的對內皮細胞的損傷和免疫學說提出的免疫細胞功能的紊亂揭示了非神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)可能在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 非神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)廣泛地分布于內皮細胞、免疫細胞、上皮細胞和間質細胞中，在人

2、類的各種組織器官中均有存在。其與神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)在乙酰膽堿合成、儲存、釋放、滅活、受體和作用方式等方面均有所不同。非神經(jīng)性M受體(NNMR)和神經(jīng)性M受體(NMR)具有不同的藥理特性。非神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)在體內調節(jié)細胞增殖分化，免疫應答，神經(jīng)發(fā)育等各種重要生理功能。然而，尚沒有關于非神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)與動脈粥樣硬化關系的研究報道。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)NNMR激動劑檳榔堿誘導離體大鼠主動脈內皮依賴性舒張反應，可被阿托品10μM

3、和NNMR特異性拮抗劑山莨菪堿0.01～10nM劑量依賴性阻斷，而能激活所有亞型NMR的毛果蕓香堿即使是在高達100μM時仍不能誘發(fā)內皮依賴性舒張反應；檳榔堿(1mg/kg/d-5mg/kg/d)在高脂飲食誘發(fā)兔的動脈粥樣硬化模型上對抗動脈粥樣硬化形成，保護血管內膜，而毛果蕓香堿5mg/kg/d不影響動脈粥樣硬化的形成，在高血脂誘發(fā)鵪鶉動脈粥樣硬化的實驗模型上，NNMR特異性拮抗劑1s-2α-2R-CHPET加重動脈粥樣硬化樣病理損傷；

4、在角叉菜膠誘發(fā)的小鼠尾動脈血栓模型上檳榔堿在0.1～4.0mg.kg<'-1>范圍內激活NNMR可劑量依賴性地對抗血栓形成，而毛果蕓香堿在劑量高達檳榔堿最低有效劑量的40倍，即4.0mg．kg<'-1>時充分激活M受體，對血栓形成仍無明顯影響。提示檳榔堿所作用的血管內皮細胞上的NNMR與神經(jīng)性M受體在藥理學特征上存在顯著差異，故不能被神經(jīng)性M受體激動劑毛果蕓香堿所激活；由于檳榔堿的作用被山莨菪堿所阻斷，表明檳榔堿通過激活NNMR而舒張血

5、管、抗血栓及抗動脈粥樣硬化。在上述研究的基礎上，本研究從體內到體外，在高脂飲食誘發(fā)ApoE<'-/->小鼠動脈粥樣硬化模型及ox-LDL誘導的動脈粥樣硬化樣炎癥反應的大鼠主動脈內皮細胞上，進一步研究激活NNMR抗動脈粥樣硬化的炎癥反應特點以及分子途徑。 一、激活．NNMR抗動脈粥樣硬化炎癥反應機制的體內(in viva)研究 在高脂飲食誘發(fā)高血脂和動脈粥樣硬化的ApoE<'-/->小鼠的實驗模型上，檳榔堿治療組分別給予7

6、和21mg/kg/d口服給藥7周，以未給檳榔堿的ApoE<'-/->小鼠作為模型對照，以普通飲食的野生型C57BL/6J小鼠作為正常對照，采用HE染色、電鏡觀察、免疫組化、實時定量PCR、Western Blot、流式細胞術、ELISA等方法進行研究。研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿(7和21mg/kg/d)可顯著減小高脂飲食ApoE<'-/->小鼠主動脈根部的動脈粥樣硬化斑塊面積和改善血管內皮動脈粥樣硬化樣損傷，具有顯著的抗動脈粥樣硬化作用。其抗炎效應

7、主要為顯著下調血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、單核趨化蛋白-1(MCP-1)的基因和蛋白表達，抑制T淋巴細胞活化介導的免疫反應。檳榔堿對于T淋巴細胞介導免疫反應的作用表現(xiàn)在三個方面：1)顯著抑制主動脈粥樣硬化斑塊處T淋巴細胞的浸潤，抑制脾臟中T淋巴細胞的增殖和CD4+/CD8+的升高；2)顯著下調主動脈上激活T淋巴細胞所需要的協(xié)同共刺激因子VLA-4、CD28、CD86和CD40L的基因表達；3

8、)顯著下調Th1型促炎相關細胞因子IFNγ和IL-12在主動脈和脾臟的基因表達，上調。Th2型抗炎相關細胞因子IL-10在主動脈中基因的表達；并顯著減少了T淋巴細胞特異性刺激劑刀豆蛋白刺激的體外培養(yǎng)的高脂飲食ApoE<'-/->小鼠的脾臟細胞分泌IFNγ，增加IL-10的產生。另一方面，檳榔堿可增加高脂飲食ApoE<'-/->小鼠血清NO含量，抑制主動脈NFκBp65亞基的基因和蛋白表達及活性，并上調主動脈PPARγ基因的表達。

9、 二、激活內皮細胞上NNMR抗動脈粥樣硬化樣炎癥反應機制的體外(in vitro)研究 在動脈粥樣硬化誘導因子ox-LDL的作用下，大鼠主動脈內皮細胞中單核趨化蛋白-1(MCP-1)基因表達增加，分泌MCP-1增多，并促進了單核細胞向內皮的粘附和遷移。檳榔堿濃度依賴地抑制了上述ox-LDL誘導的病理改變。免疫組化顯示了檳榔堿顯著抑制ox-LDL誘導的NFκB核轉位，凝膠電泳遷移實驗則揭示了檳榔堿顯著減弱NFKB與DNA的結合活性

10、。檳榔堿抑制MCP-1基因表達、分泌、單核細胞粘附和NFκB-DNA結合活性的作用被M受體的拮抗劑阿托品所阻斷。表明檳榔堿通過激活內皮細胞NNMR發(fā)揮抗炎作用。 三、靶向內皮細胞NNMR哌芳安他抗動脈粥樣硬化樣炎癥反應新機制的體外(in vitro)研究 哌芳安他是以內皮細胞NNMR為靶點設計合成的新結構化合物，已經(jīng)證明具有調節(jié)內皮細胞活性和抗動脈粥樣硬化作用。在ox-LDL誘導的大鼠主動脈內皮細胞上，哌芳安他促進生成N

11、O，從而顯著抑制ox-LDL誘導的MCP-1分泌和單核細胞-內皮細胞粘附。同時發(fā)現(xiàn)了哌芳安他顯著上調ox-LDL抑制的PPARγ,的基因表達。 在先前研究的基礎上，本課題在高脂飲食誘發(fā)動脈粥樣硬化的ApoE<'-/->小鼠的實驗模型上進一步研究檳榔堿激活NNMR抗動脈粥樣硬化的特點和機制，發(fā)現(xiàn)檳榔堿可通過調節(jié)T淋巴細胞免疫活性和Th1/Th2反應的平衡而抑制炎癥反應，可通過生成NO、抑制NFκB活性和促進PPARγ基因表達而抗動