1、目的:探討柚皮素對(duì)炎性刺激時(shí)氣道上皮細(xì)胞黏液高分泌的作用和相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 方法:(1)體外培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞系HBE16細(xì)胞,將細(xì)胞分為7組,分別以0、20、50、80、100、200、400μmol/L的柚皮素處理,采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT法)檢測(cè)柚皮素對(duì)細(xì)胞活性的影響,并確定柚皮素的作用劑量。(2)給予不同濃度(5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L)的人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(HNE)刺激24

2、h,觀察刺激前后細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖情況,分別采用ELISA技術(shù)及PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中MUC5AC蛋白含量及轉(zhuǎn)錄水平的變化情況,并測(cè)定活性氧(ROS)成分的相對(duì)含量；(3)將細(xì)胞分為5組:①對(duì)照組；②HNE(50nmol/L)刺激組；③柚皮素(100μmol/L)干預(yù)組；④活性氧清除劑DMTU(20μmol/L)干預(yù)組；⑤柚皮素(100μmol/L)+DMTU(20μmol/L)干預(yù)組。逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)各組MUC5A

3、C mRNA、EGFR mRNA的變化；Western免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)EGFR、p-EGFR、P13K、PKB、p-PKB和NF-kB蛋白的表達(dá)；酶鏈免疫吸附法(ELISA)定量分析MUC5AC蛋白含量的差異；激光共聚焦技術(shù)進(jìn)一步直接觀察MUC5AC蛋白含量的變化；
　　 結(jié)果:(1)MTT結(jié)果顯示柚皮素濃度低于100μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯損傷,隨著濃度遞增,當(dāng)柚皮素濃度達(dá)2001μmol/L和40

4、0μmol/L時(shí)細(xì)胞貼壁能力降低,死亡細(xì)胞增多,細(xì)胞生存率明顯下降,此表明100μmol/L的柚皮素為最佳作用劑量；(2)在5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L的HNE刺激后的各組細(xì)胞中MUC5AC的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白含量均增高,ROS含量亦隨之增加,呈濃度依賴性增高,均高于正常對(duì)照組；給予柚皮素預(yù)處理后ROS的含量明顯減少,與50nmol/L的HNE刺激組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)。(3)50nmol/L的HN

5、E刺激后引起MUC5AC、EGFR基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P〈0.01),同時(shí)伴隨p-EGFR、P13K、PKB、p-PKB及NF-kB蛋白水平的增高,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；柚皮素干預(yù)后,RT-PCR測(cè)定MUC5AC mRNA和EGFR mRNA均較HNE刺激組明顯下調(diào),Western blot的結(jié)果也表明相應(yīng)的EGFR和p-EGFR蛋白表達(dá)明顯降低,其下游因子P13K、PKB、p-PKB

6、及NF-kB蛋白表達(dá)也有不同程度的減弱(P<0.05)；DMTU和柚皮素+DMTU均同樣降低了MUC5AC、EGFR的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白產(chǎn)物水平以及p-EGFR、P13K、PKB、p-PKB及NF-kB蛋白相對(duì)含量；柚皮素+DMTU干預(yù)組與單純性柚皮素組和DMTU組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；酶鏈免疫吸附法測(cè)定結(jié)果表明經(jīng)柚皮素預(yù)處理后MUC5AC蛋白表達(dá)減少；激光共聚焦觀察結(jié)果也顯示柚皮素處理后HBE16細(xì)胞質(zhì)中MUC5AC蛋白

7、表達(dá)減弱。
　　 結(jié)論:(1)HNE能刺激氣道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成分泌增加,且伴有ROS含量的顯著增高；而柚皮素能降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。(2)HNE通過(guò)增加ROS含量,上調(diào)EGFR的表達(dá)水平和增加其磷酸化水平引起MUC5AC表達(dá)增強(qiáng)。(3)柚皮素可抑制RDS的產(chǎn)生、下調(diào)ROS誘導(dǎo)的EGFR.表達(dá)水平、并部分阻斷EGFR磷酸化,在一定程度上阻斷了下游信號(hào)通路P13K/PKB的作用,從而對(duì)炎性刺激因素所導(dǎo)致的