1、目的：蛋白質(zhì)組學(xué)可動態(tài)、整體、定量地觀察腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變，結(jié)合功能蛋白質(zhì)組的研究，依托大規(guī)模雙向電泳和質(zhì)譜分析的體系和生物信息學(xué)分析技術(shù)，有希望找到控制腫瘤進(jìn)程關(guān)鍵作用的蛋白分子。本研究擬采用雙向電泳分離結(jié)直腸癌與正常組織的總蛋白質(zhì)，建立雙向電泳圖譜，尋找表達(dá)差異點(diǎn)，通過質(zhì)譜分析鑒定，尋找與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)。應(yīng)用Realtime-PCR、Western blot和免疫組化等方法在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平對其表達(dá)

2、差異進(jìn)行驗證，并分析其與結(jié)直腸癌組織學(xué)分級、臨床分期和預(yù)后等的關(guān)聯(lián)性。以期通過此研究，為進(jìn)一步揭示結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制，尋找有意義的腫瘤標(biāo)記物及藥物治療的靶點(diǎn)，提供新的線索和思路。
　　 方法：⑴收集外科手術(shù)切除的12例結(jié)直腸腺癌和配對的12例正常結(jié)直腸粘膜新鮮組織標(biāo)本，通過雙向電泳技術(shù)分離總蛋白，得到12組雙向電泳凝膠圖譜。采用Imaging Master2D分析軟件進(jìn)行合成、比對和差異分析，尋找結(jié)直腸癌組織和正常組織之間的差異表

3、達(dá)蛋白斑點(diǎn)。選取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行差異蛋白質(zhì)鑒定。⑵應(yīng)用Realtime PCR和Western blot方法從mRNA水平和蛋白水平對候選分子Prohibitin(PHB)和14-3-3ζ在結(jié)直腸腺癌和配對正常腸粘膜組織的表達(dá)差異進(jìn)行驗證。⑶組織芯片結(jié)合免疫組化方法檢測PHB和14-3-3ζ在187例結(jié)直腸腺癌、150例正常腸粘膜組織和62例腺瘤石蠟標(biāo)本

4、中的表達(dá)，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法對這兩種蛋白在不同組織間的表達(dá)差異性和組織學(xué)分級、病理分期和預(yù)后等關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：①12組結(jié)直腸癌與正常組織的雙向電泳圖譜分辨率高、重復(fù)性好，每塊凝膠檢測平均蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為985±45和1012±53。選擇表達(dá)差異2倍以上的40個點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索成功鑒定出35個蛋白，其中17個在癌組織中上調(diào)，18個下調(diào)。對鑒定出的差異蛋白進(jìn)行了功能和細(xì)胞定位的分析和歸類，選擇確定結(jié)直腸癌

5、相關(guān)蛋白候選分子PHB和14-3-3ζ進(jìn)行深入研究。②Western blot結(jié)果顯示，與正常結(jié)直腸粘膜組織相比，PHB蛋白和14-3-3ζ蛋白在結(jié)直腸癌癌組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。③免疫組化結(jié)果顯示PHB蛋白在結(jié)直腸癌癌組織中表達(dá)顯著高于正常組織和腺瘤組織(P＜0.01)；但PHB蛋白在正常粘膜組織和腺瘤中表達(dá)未見差異(P＞0.05)。14-3-3ζ蛋白在正常粘膜組織、腺瘤組織和癌組織的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高

6、的趨勢(P＜0.001)。在癌組織中，PHB和14-3-3ζ蛋白表達(dá)與病理分級呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)；但與患者性別、年齡、腫瘤大小、發(fā)病部位、臨床分期及預(yù)后無關(guān)聯(lián)性(P＞0.05)。4.Realtime PCR結(jié)果顯示PHB mRNA和14-3-3ζmRNA在結(jié)直腸癌癌組織中與正常組織中無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：⑴運(yùn)用雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)分析方法篩選并鑒定出的35個差異蛋白質(zhì)可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生

7、、發(fā)展有關(guān)。⑵應(yīng)用WesternBlot，組織芯片結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)驗證篩選差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)PHB在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著上調(diào)，而腺瘤與正常粘膜組織相比表達(dá)未見差異。從正常粘膜組織、腺瘤組織到癌組織，14-3-3ζ蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。PHB、14-3-3ζ表達(dá)與結(jié)直腸癌癌組織的分化程度相關(guān)，隨著分化程度的降低其表達(dá)逐漸增強(qiáng)。⑶PHB和14-3-3ζ可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，其機(jī)制與PHB和14-3-3ζ基因的轉(zhuǎn)錄