1、本研究采用以表皮生長因子為主要誘導物質(zhì)的誘導劑，而表皮生長因子主要通過MAPK途徑對細胞分化進行調(diào)控。因此采用以表皮生長因子為主的誘導劑在體外誘導MSCs分化成表皮細胞，然后利用在誘導劑中分別加入p38途徑和ERK途徑的特異性抑制劑SB203580和PD98059，從而初步探討p38途徑和ERK途徑對體外誘導MSCs分化成表皮細胞的影響。研究工作分為兩部分： 第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及誘導分化為表皮細胞觀

2、察。 研究目的：研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外誘導分化為表皮細胞的觀察。 研究方法：將大鼠處死，無菌條件下用密度梯度離心法分離大鼠MSCs，在37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察MSCs的生長情況及形態(tài)特征，培養(yǎng)至第3代的間充質(zhì)干細胞用免疫細胞化學檢測表面標記CD34、CD44的表達，同時用流式細胞儀測定CD34、CD44的陽性率，從而對分離的MSCs進行鑒定。細胞隨機分為對照組

3、、誘導組，誘導7d時用免疫細胞化學染色法和流式細胞儀技術(shù)檢測MSCs表面CK5/8和CK19的表達。免疫細胞化學染色采用兩步法，具體操作按試劑盒說明書進行。同時設(shè)不加一抗的陰性對照。在光學顯微鏡下進行組織學觀察，以胞漿呈棕黃色著色為陽性結(jié)果，而流式細胞儀通過細胞計數(shù)直接給出二者的陽性率。 研究結(jié)果：①采用密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離出的MSCs在倒置相差顯微鏡下呈克隆樣生長，12d左右達到細胞融合，細胞形態(tài)呈比較均一的梭形，傳

4、代后細胞形態(tài)無變化。②免疫細胞化學檢測第三代的MSCs顯示CD44均呈陽性，CD34均呈陰性，流式細胞儀檢測顯示細胞表面抗原CD44陽性率96.62％，CD34陽性率2.58％。③體外特定條件下可誘導MSCs分化為表皮細胞，MSCs誘導3天時，免疫細胞化學顯示MSCs中出現(xiàn)少量角蛋白5/8(CK5/8)、角蛋白19(CK19)陽性表達細胞，7天時陽性表達細胞明顯增多，對照組二者均陰性表達，流式細胞儀檢測顯示CK5/8、CK19陽性率分別

5、為3.01％、6.47％。 第二部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為表皮細胞信號機制研究。 研究目的：通過在誘導劑中添加SB203580、PD98059，初步探討MAPK信號途徑對MSCs誘導分化為表皮細胞的調(diào)控機制。 研究方法：隨機將細胞分為誘導組、p38阻斷組、ERK阻斷組，在誘導至第7天時將細胞取出進行免疫細胞化學染色和流式細胞儀檢測CK5/8、CK19染色陽性率，探討MAPK信號途徑對MSCs誘導分化為表

6、皮細胞的影響。所有數(shù)據(jù)均以-x±s表示，采用X2檢驗，SPSS軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。 研究結(jié)果：①鏡下連續(xù)觀察各組細胞生長情況良好，形態(tài)無明顯變化。②誘導7d時，免疫細胞化學檢測誘導組CK5/8、CK19陽性率分別為(5.84±3.92)％、(8.34±3.42)％；p38阻斷組二者陽性率分別為(1.70±2.16)％、(6.48±4.14)％，低于誘導組(P＜0.05，P＜0.05)；ERK阻斷組二者陽性率分別為(9.

7、42±3.73)％、(12.98±5.13)％，高于誘導組(P＜0.05，P＜0.05)，也明顯高于p38阻斷組(P＜0.01，P＜0.01)。③MSCs誘導7天時流式細胞儀顯示誘導組CK5/8、CK19陽性率分別為3.01％、6.47％；p38阻斷組CK5/8、CK19陽性表達率分別為1.43％、5.41％，低于誘導組(P＜0.01，P＜0.01)；ERK阻斷組CK5/8、CK19陽性表達率分別為5.54％、7.56％，高于誘導組(P

8、＜0.01，P＜0.05)，也高于p38阻斷組(P＜0.01，P＜0.01)。④油紅O脂肪染色發(fā)現(xiàn)p38阻斷組有少量陽性表達細胞，其它組均為陰性。 研究結(jié)論： 1.從大鼠骨髓中分離出的MSCs形態(tài)呈均一的梭形，純度高，免疫細胞化學及流式細胞儀檢測顯示CD44陽性，CD34陰性。 2.EGF可誘導MSCs分化為表皮細胞，免疫細胞化學及流式細胞儀檢測顯示CK5/8、CK19陽性。 3.p38途徑在促進MSCs