1、實驗背景:
　　 心肌梗死(myocardial infarction,MI)后繼發(fā)心肌細胞代償性肥大、細胞壞死或凋亡以及細胞外基質(zhì)成分改變,心室大小、形狀、室壁厚度和組織結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生一系列變化,這一病變修復(fù)和心室整體代償及繼發(fā)的病理生理反應(yīng)過程稱為心室重構(gòu)。MI后心室重構(gòu)常常導(dǎo)致心臟舒縮功能障礙、心律失常等,是引起心力衰竭的主要原因。目前充血性心力衰竭發(fā)病率逐年升高,為目前全球范圍內(nèi)致死和致殘的主要疾病之一。
　　 近年

2、來藥物治療和介入治療得到了快速發(fā)展,缺血性心肌病患者的預(yù)后有了明顯的改善,但藥物治療和介入治療終歸不能修復(fù)壞死的心肌。隨著對干細胞(slemcells)研究的不斷加深,認(rèn)為干細胞具有組織再生的功能,在體內(nèi)能分化成為其他成熟細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力和橫向分化能力,移植到心梗局部后能夠分化為內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和心肌細胞樣細胞,促進新生血管的形成。大量的研究,包括基

3、礎(chǔ)研究和臨床前期研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠挽救瀕死的心肌,減少心梗面積,改善心室重構(gòu)進而提高心功能。然而MSCs如何改善心梗后心室重構(gòu)的分子機制尚不明確。
　　 以往有研究顯示移植后MSCs通過降低心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)的合成和活性來改善心室重構(gòu)。MMPs是一組能特異的降解細胞外基質(zhì)成分的酶家族,能使膠原纖維降解增加,心肌膠原結(jié)構(gòu)受到破壞,使左室的大小和形狀發(fā)生改變,最終

4、影響心肌的收縮力?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)是MMPs特異性的內(nèi)源性抑制劑。而心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CFs)是心臟中分泌和合成MMPs和TIMPs的主要細胞。因此,我們推測,MSCs可能通過旁分泌作用影響CFs合成和分泌MMPs,從而起到改善心室重構(gòu)的作用。
　　 實驗?zāi)康?研究體外MSCs能否通過旁分泌

5、作用影響CFs的MMPs的合成,并對可能的作用機制進行探討。
　　 實驗方法:體外模擬心肌梗死,建立缺氧模型,CFs分為正常對照組(CFs),缺氧組(H-CFs),MSCs共培養(yǎng)組(H-CFs-MSCs)以及缺氧預(yù)處理MSCs共培養(yǎng)組(H—CFs-HMSCs)共四組。應(yīng)用明膠酶譜的方法檢測四組MMP-2及MMP-9的活性變化。Western-blot檢測MSCs與H-CFs共培養(yǎng)后,能否減弱H-CFs的MMP-2、MMP-9、M

6、T1-MMP(membrane type1-MMP)及TIMP-1的合成。在MSCs(或H-MSCs)和H-CFs的共培養(yǎng)基中加入促紅細胞生成素可溶性受體(erythropoietin soluble receptor,EPOsR)或者促紅細胞生成素中和性抗體(erythropoietin neutralizing antibody,EPOAb),再次采用明膠酶譜以及Western-blot方法檢測上述指標(biāo)變化。我們進一步采用Weste

7、rn-blot檢測了與MMPs的合成、缺氧以及EPO密切相關(guān)的信號通路ERK1／2和AKT的變化。
　　 實驗結(jié)果:明膠酶譜結(jié)果顯示,CFs缺氧24小時處理后(H-CFs)分泌的MMP-2活性比CFs的明顯增高；H-CFs分別與MSCs和HMSCs共培養(yǎng)后(H-CFs-MSCs,H—CFs—HMSCs),MMP-2的活性又降低；而MMP-9在CFs、H-CFs、H-CFs-MSCs和H-CFs-HMSCs四組中均沒有明顯變化。W

8、estern-blot結(jié)果顯示H-CFs中MMP-2蛋白表達較CFs明顯增高(P<0.01),共培養(yǎng)組H-CFs-MSCs及H-CFs-HMSCs的MMP-2的表達又下降。MT-1MMP在MMP-2的激活過程中起著協(xié)同作用,因此我們也檢測了MT1-MMP的表達,發(fā)現(xiàn)MT1-MMP的變化與MMP-2的變化一致。H-CFs中的TIMP-1蛋白水平比CFs的明顯降低,共培養(yǎng)組H-CFs-MSCs及H-CFs-HMSCs中的TIMP-1表達又增

9、加。與明膠酶譜的結(jié)果一致,在MMP-9在CFs、H-CFs、H-CFs-MSCs和H-CFs-HMSCs四組中均沒有明顯變化。在共培養(yǎng)基中加入EPOsR或者EPOAb,均能逆轉(zhuǎn)MSCs和HMSCs對H-CFs合成MMPs的變化。缺氧能夠明顯增加CFs中的ERK1／2的磷酸化水平,MSCs共培養(yǎng)能夠減少ERK1／2的磷酸化表達水平；EPO阻滯劑EPOsR和EPOAb均能逆轉(zhuǎn)MSCs共培養(yǎng)對CFs中磷酸化ERK1／2的影響,而AKT信號通路

10、無明顯變化。在我們的研究中,MSCs和HMSCs對CFs合成MMPs的影響無明顯區(qū)別。
　　 實驗結(jié)論:
　　 1.MSCs能通過旁分泌作用減少缺氧后CFs的MMP-2、MT1-MMP的表達,增加TIMP-1表達。
　　 2.EPO在MSCs對CFs合成MMP和TIMP-1的旁分泌作用中是一個關(guān)鍵的細胞因子。
　　 3.ERK1／2信號通路在MSCs影響CFs的MMP和TIMP-1的合成中發(fā)揮了重要作用。