1、目的:體外模擬心肌微環(huán)境，探討心臟細胞旁分泌作用誘導BM-MSCs向心肌細胞分化的相關機制。
　　 方法:分離培養(yǎng)大鼠心肌細胞、心臟成纖維細胞、BM-MSCs。
　　 將大鼠BM-MSCs分別與心肌細胞、心臟成纖維細胞建立共培養(yǎng)體系，RT-PCR方法檢測BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)蛋白的核酸表達，分析心肌細胞、心臟成纖維細胞對BM-MSCs向心肌細胞分化的誘導作用。
　　 根據(jù)不同誘導方法，將培養(yǎng)BM-

2、MSCs分為四組，A：陰性對照組；B：單純Wnt11誘導組；C：心肌細胞誘導組；D：心肌細胞+Wnt11誘導組。各組細胞均共培養(yǎng)14天，應用RT-PCR或Western blot方法檢測BM-MSCs各信號通路（Wnt,BMP,Notch,FGF,Hedgehog）關鍵信號分子的表達，分析心肌細胞旁分泌作用誘導BM-MSCs向心肌細胞分化的相關信號通路的作用機制。
　　 在共培養(yǎng)體系中，加入BMP信號通路的抑制劑Noggin，R

3、T-PCR方法檢測BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)蛋白的核酸表達，分析BMP信號通路在心肌細胞旁分泌作用誘導BM-MSCs向心肌細胞分化過程中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1. 細胞培養(yǎng)成功建立了心肌細胞、心臟成纖維細胞的分離、純化、鑒定、擴增及與BM-MSCs共培養(yǎng)的方法體系。
　　 2. 心肌細胞、心臟成纖維細胞對BM-MSCs向心肌細胞分化的誘導作用與陰性對照組比較，心肌細胞誘導組Nkx-2.5、α-

4、MHC、β-MHC、cTnI表達顯著增強；與陰性對照組相比，成纖維細胞誘導組Nkx-2.5、α-MHC、β-MHC、cTnI的表達變化不明顯，其差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3. BM-MSCs向心肌細胞分化時，相關信號通路關鍵信號分子表達變化RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，心肌細胞誘導組和心肌細胞+Wnt11誘導組Wnt經(jīng)典通路、BMP、Notch和Hedgehog信號通路關鍵信號分子的表達明顯升高；與單純Wnt11誘

5、導組比較，心肌細胞誘導組和心肌細胞+Wnt11誘導組Wnt經(jīng)典通路、BMP、Notch、Hedgehog信號通路關鍵信號分子的表達升高；各組中FGF信號通路Frs2表達變化不明顯，各組間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，單純Wnt11誘導組、心肌細胞誘導組和心肌細胞+Wnt11誘導組Wnt非經(jīng)典通路中p-JNK的表達增強；與單純Wnt11誘導組比較，心肌細胞誘導組和心肌細胞+Wnt11

6、誘導組p-JNK的表達較低。
　　 4. BMP信號通路對BM-MSCs向心肌細胞分化的影響共培養(yǎng)體系中加入BMP信號通路的抑制劑Noggin，RT-PCR結(jié)果顯示，與未加抑制劑組相比較，BM-MSCs中Nkx-2.5、GATA4、α-MHC、β-MHC、cTnI、ANP、Mef2c的表達均明顯降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.心肌細胞旁分泌作用可誘導BM-MSCs向心肌細胞分化，心臟成纖維細胞無此作用。