1、目的:各種病因造成心肌組織不可逆損傷均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量的減少、心肌丟失。成年心肌再生能力差，壞死心肌無(wú)法通過(guò)自身的增殖、分化進(jìn)行修復(fù)，丟失的心肌被瘢痕組織替代，造成心臟重構(gòu)、心功能下降，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭的發(fā)生。成體心肌細(xì)胞的再生是醫(yī)學(xué)界急待解決的難題之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mensenchymalstemcell，MSCs)所具有的多能分化特性為心肌細(xì)胞再生的研究提供了新的方向和思路。骨髓中MSCs的含量非常少，必需在體外分離純化

2、、培養(yǎng)擴(kuò)增才能滿足要求，而如何獲得大量純化的MSCs則成為臨床利用這些細(xì)胞治療疾病的前提。1999年Makino等首次體外給予3μmol/L的5-氮胞苷(5-Azacytidine，5-aza)誘導(dǎo)MSCs定向分化心肌樣細(xì)胞獲得成功，開(kāi)創(chuàng)了MSCs體外誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞研究的先河。但仍然存在著誘導(dǎo)出功能性心肌樣細(xì)胞的重復(fù)性差、誘導(dǎo)比率低、誘導(dǎo)條件不成熟等問(wèn)題。已有研究證實(shí)，脈沖電磁場(chǎng)(pulsedelectromagneticfield

3、s，PEMFs)可以促進(jìn)MSCs向成骨方向分化。但其對(duì)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化有無(wú)影響尚不清楚。因此本研究擬在用5-aza體外誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的基礎(chǔ)上，探討電磁場(chǎng)對(duì)MSCs的增殖及向心肌樣細(xì)胞分化的影響。 方法1.通過(guò)對(duì)比不同鼠齡、不同純化方法對(duì)大鼠MSCs集落形成和生長(zhǎng)特性的影響，篩選大鼠MSCs分離、培養(yǎng)的條件，選取CD44、CD105細(xì)胞免疫組化方法對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行初步鑒定。 2.取第三代大鼠MSCs

4、隨機(jī)分A、B、C為三組，分別加入5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L的5-aza；每組分別孵育12h、24h和48h，繼續(xù)培養(yǎng)28d。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及電境觀察誘導(dǎo)前后超微結(jié)構(gòu)變化，細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測(cè)α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)和心肌肌鈣蛋白T(cardiactroponinT，cTnT)表達(dá)，并通過(guò)Western印跡法對(duì)細(xì)胞cTnT進(jìn)行半定量分析。 3.50Hz的PEMFs干預(yù)5-aza誘導(dǎo)7d后

5、的大鼠MSCs，0.5mT、1mT和5mT三種感應(yīng)強(qiáng)度分別為A、B、C三組，各組根據(jù)暴露時(shí)間10min/d、20min/d、30min/d及60min/d又分1、2、3、4亞組，作用4d后采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖變化，作用14d后流式檢測(cè)細(xì)胞周期和Western印跡法檢測(cè)cTnT的表達(dá)，了解PEMFs對(duì)體外誘導(dǎo)的大鼠MSCs增殖和分化的影響。 結(jié)果1.2月齡大鼠比6月齡大鼠操作方便、集落形成率高、增殖性強(qiáng)。全骨髓貼壁篩選組原代培

6、養(yǎng)5d大鼠MSCs形成集落數(shù)顯著多于Percoll密度離心組；細(xì)胞組分比Percoll密度離心組復(fù)雜，但P3代以后兩者細(xì)胞組分基本一致，CD44、CD105細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測(cè)，兩組陽(yáng)性率均為90％左右。 2.5-aza誘導(dǎo)28d大鼠MSCs的α-actin、cTnT免疫化學(xué)染色陽(yáng)性；透射電鏡觀察可見(jiàn)誘導(dǎo)后大鼠MSCs細(xì)胞內(nèi)有肌絲樣結(jié)構(gòu)形成；Western印跡顯示誘導(dǎo)后的大鼠MSCs表達(dá)心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白cTnT，5μmol/L

7、的5-aza孵育48h、10μmol/L孵育24h與10μmol/L的5-aza孵育48h、20μmol/L三個(gè)孵育時(shí)間組大鼠MSCs的cTnT表達(dá)量高于其余各組，但后者的細(xì)胞生物學(xué)特性受到明顯影響。 3.50Hz的PEMFs分組作用于5-aza誘導(dǎo)后的大鼠MSCs，0.5mT和1mT感應(yīng)強(qiáng)度下暴露20min～30min/d顯著性促進(jìn)大鼠MSCs增殖，5mT暴露30min/d和60min/d以及1mT暴露60min/d顯著性抑制

8、大鼠MSCs增殖。各感應(yīng)強(qiáng)度下暴露60min/d以及5mT感應(yīng)強(qiáng)度下暴露20min/d以上均引起大鼠MSCs細(xì)胞周期S+G2％的下降，0.5mT和1mT暴露20min～30min/d內(nèi)引起大鼠MSCs細(xì)胞周期S+G2％增高。 4.Western印跡檢測(cè)cTnT的表達(dá)量結(jié)果顯示0.5mT暴露60min/d內(nèi)、1mT暴露20min/d和30min/d、5mT暴露20min/d和30min/d的cTnT表達(dá)量較對(duì)照組均增加；僅5mT暴

9、露10min/d的cTnT的表達(dá)量減少；其余cTnT的表達(dá)量變化不明顯。 結(jié)論1.大鼠MSCs在體外經(jīng)5-aza誘導(dǎo)后可分化為心肌樣細(xì)胞；5μmol/L的5-aza孵育48h和10μmol/L的5-aza孵育24h是大鼠MSCs體外誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞的理想條件。 2.PEMFs可以促進(jìn)大鼠MSCs增殖，在50Hz、0.5mT和1mT感應(yīng)強(qiáng)度下暴露20min～30min/d條件下作用顯著。 3.PEMFs能促進(jìn)大鼠