1、目的：研究乳腺癌MCF-7細(xì)胞中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)信號(hào)通路,篩選抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的多肽適配體,從而探索治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。
　　方法：運(yùn)用免疫熒光與蛋白質(zhì)印跡(western blotting)檢測NGF及其高親和力受體TrkA(酪氨酸激酶受體A)在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá);運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法(cellcounting kit-8,CCK-8)檢測不同濃度的NGF阻斷劑Ro 08-275

2、0和酪氨酸酶阻斷劑K252a對(duì)細(xì)胞增殖和存活的影響;運(yùn)用western blotting檢測不同濃度Ro 08-2750處理后的細(xì)胞表達(dá)活性促分裂素原活化蛋白激酶(active-mitogen-activated proteinkinases,active-MAPK)與p53蛋白變化情況;運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度Ro08-2750處理后的細(xì)胞凋亡情況以及細(xì)胞周期分布的變化;運(yùn)用多肽適配體技術(shù)將5種特異性結(jié)合Ras蛋白不同位點(diǎn)的多肽適配

3、體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,并運(yùn)用CCK-8法檢測MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖情況,運(yùn)用western blotting檢測表達(dá)active-MAPK蛋白與p53蛋白的變化,以及運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞同時(shí)表達(dá)NGF及其受體TrkA蛋白;NGF阻斷劑Ro 08-2750能夠明顯地抑制細(xì)胞增殖與存活,并具有劑量效應(yīng);經(jīng)不同濃度Ro08-2750處理細(xì)胞后p-ERK 1/2表達(dá)量上調(diào),p53表達(dá)下

4、調(diào),細(xì)胞出現(xiàn)凋亡峰,并出現(xiàn)S期細(xì)胞含量上升,62期細(xì)胞含量下降:轉(zhuǎn)染的5種多肽適配體中,pPER39R能明顯抑制細(xì)胞的增殖和存活,p53的表達(dá)上調(diào),并出現(xiàn)顯著的凋亡峰,然而pPER39R對(duì)正常背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞DRG(dorsal root ganglion)細(xì)胞沒有任何抑制作用。
　　結(jié)論：乳腺癌MCF-7細(xì)胞中存在NGF信號(hào)通路,當(dāng)使用特異性的NGF阻斷劑Ro 08-2750處理,MCF-7細(xì)胞的增殖和存活受到明顯抑制,出現(xiàn)S期停