1、角膜基質(zhì)細胞(corneal stroma cells，CSCs)是散在分布于角膜基質(zhì)內(nèi)神經(jīng)嵴來源的細胞，對維持角膜透明性發(fā)揮著重要作用。在體CSCs數(shù)量稀少，所以在體外對細胞進行培養(yǎng)擴增是必經(jīng)的研究路徑。研究表明，培養(yǎng)于含胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基內(nèi)的CSCs會喪失其原有的生物學特性。然而，當培養(yǎng)于無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，細胞雖能保持其特性不變，卻無法進行有效增殖。因此，如何在保持細胞生物學特性不變的情況下高效擴增CSCs，是目前研

2、究難點之一。
　　 研究表明，出生后增殖性CSCs的細胞數(shù)量會迅速減少。當瞼裂打開后，所有CSCs的細胞周期進入G0期。最近研究證實，CSCs表達眾多干細胞標記物，并且具有多向分化潛能，與間充質(zhì)干細胞的生物學特性十分相似。然而，目前尚缺乏小鼠CSCs是否具有間充質(zhì)干細胞特性的研究。
　　 樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是目前已知體內(nèi)功能最強的抗原呈遞細胞。成熟DCs可引發(fā)機體免疫反應，而未成熟DCs

3、則會誘導機體免疫耐受。而且，角膜內(nèi)的DCs廣泛的參與了多種角膜相關(guān)疾病以及角膜移植免疫排斥反應，且以角膜內(nèi)DCs為靶細胞的治療方法已取得可喜的療效。因此，對角膜內(nèi)的DCs，尤其對DCs成熟狀態(tài)的研究具有重要意義。
　　 最近研究表明，位于角膜中央?yún)^(qū)的DCs完全處于未成熟狀態(tài)，而位于角膜周邊區(qū)的DCs則大多處于成熟狀態(tài)。局部微環(huán)境對DCs的成熟狀態(tài)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。所以，我們推測CSCs可能具有影響角膜內(nèi)DCs成熟狀態(tài)的功能，

4、然而至今尚未見相關(guān)報道。
　　 因此，本研究旨在探索如何在體外有效擴增小鼠CSCs以及對CSCs的間充質(zhì)干細胞特性和抑制DCs成熟的功能進行探討。如下：
　　 第一部分小鼠角膜基質(zhì)細胞的提取、鑒定以及培養(yǎng)擴增
　　 目的：研究使用KSFM培養(yǎng)基能否獲取具有增殖能力且保持生物學特性不變的小鼠CSCs。
　　 方法：將中央?yún)^(qū)角膜置于EDTA液(20mmol/L)內(nèi)孵育45min后，用手術(shù)顯微鑷小心剝離角膜上皮

5、層以及內(nèi)皮層，并將獲取的角膜基質(zhì)置于含300U/mLⅠ型膠原酶的溶液中消化4h。離心后采用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM完全培養(yǎng)基（含10％FBS）以及KSFM培養(yǎng)基重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，并采用含1U/mL分散酶的EDTA液消化傳代細胞。同時，觀察細胞并繪制細胞生長曲線；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測細胞角膜蛋白多糖(keratocan)、乙醛脫氫酶(ALDH)、細胞角蛋白12(CK12)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(

6、NSE)等基因的表達情況；采用細胞免疫熒光染色以及蛋白質(zhì)印跡方法檢測細胞keratocan蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：通過膠原酶消化的方法可以從每只小鼠的角膜基質(zhì)獲取約1×104單個細胞。RT-PCR結(jié)果顯示：原代細胞表達CSCs標記物keratocan和ALDH，不表達角膜上皮細胞標記物CK12以及角膜內(nèi)皮細胞標記物NSE;免疫熒光染色和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示：原代細胞表達keratocan蛋白。因此，本實驗獲取的原代細胞為CS

7、Cs。培養(yǎng)于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)的原代CSCs無法增殖。培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)的CSCs可增殖，但第3代細胞不表達keratocan和ALDH基因以及keratocan蛋白。培養(yǎng)于KSFM培養(yǎng)基內(nèi)的CSCs也可增殖，第3代細胞仍表達keratocan和ALDH基因以及keratocan蛋白，且與原代細胞相比，表達強度無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：KSFM培養(yǎng)基不僅能維持小鼠CSCs的生物學特性不變，還能有效促進

8、細胞增殖。
　　 第二部分小鼠角膜基質(zhì)細胞的間充質(zhì)干細胞樣表型以及多向分化潛能
　　 目的：研究KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增后的小鼠CSCs是否具有間充質(zhì)干細胞樣表型以及多向分化潛能。
　　 方法：在去除角膜上皮層以及內(nèi)皮層后，通過膠原酶消化的方法獲取小鼠中央?yún)^(qū)角膜來源的CSCs，并采用KSFM培養(yǎng)基對其培養(yǎng)擴增。收集第2代CSCs，將細胞與造血干細胞標記物抗體（CD34-FITC、CD45-PE）以及間質(zhì)細胞標記物抗

9、體(CD105-PE、CD90-FITC、CD71-FITC、CD29-APC)共孵育30min后，應用流式細胞技術(shù)進行檢測。當培養(yǎng)于KSFM培養(yǎng)基內(nèi)的CSCs達細胞融合后，更換成骨細胞誘導培養(yǎng)基（含10％ FBS、100nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-磷酸甘油、50mg/L維生素C的DMEM培養(yǎng)基）、脂肪細胞誘導培養(yǎng)基（含10％FBS、0.5μmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10mg/L胰島

10、素的DMEM培養(yǎng)基）以及對照培養(yǎng)基（含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基），進行常規(guī)培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)基。21d后，對培養(yǎng)于成骨細胞誘導培養(yǎng)基以及對照培養(yǎng)基內(nèi)的細胞進行2％茜素紅S染色，并通過RT-PCR檢測細胞堿性磷酸酶和骨鈣素等基因的表達情況；對培養(yǎng)于脂肪細胞誘導培養(yǎng)基以及對照培養(yǎng)基內(nèi)的細胞進行0.3％油紅O染色，并通過RT-PCR檢測細胞脂蛋白脂酶和過氧化物酶增殖物激活受體γ等基因的表達情況。
　　 結(jié)果：應用流式細胞技術(shù)

11、對第2代CSCs的表型特征進行分析，結(jié)果顯示：細胞低表達CD34（3.68％±1.44％）以及CD45（9.56％±1.83％），高表達CD29（96.85％±1.91％）、CD90（93.62％±1.65％）、CD105(50.91％±2.56％)以及CD71（45.27％±3.56％）。在成骨誘導條件下，3d時，細胞形態(tài)仍然保持梭形，與對照組細胞無明顯差別。7d時，細胞形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，胞漿內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒。14d時，開始形成礦化

12、結(jié)節(jié)，并逐漸增大，21d時，經(jīng)茜素紅S染色，結(jié)節(jié)呈現(xiàn)鮮紅色。對照組細胞未顯現(xiàn)出以上成骨細胞分化的形態(tài)學征象，且經(jīng)茜素紅S染色未見陽性結(jié)果。通過RT-PCR檢測成骨細胞標記物基因的表達情況，結(jié)果顯示：成骨誘導條件下細胞高表達堿性磷酸酶和骨鈣素，而對照組細胞低表達堿性磷酸酶且不表達骨鈣素。在脂肪誘導條件下，7d時，細胞形態(tài)逐漸由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)轭悎A形，胞漿內(nèi)液滴也逐漸增多。14d時，細胞胞漿內(nèi)滿布液滴，經(jīng)油紅O染色，液滴被特異性染成橘紅色。RT-

13、PCR結(jié)果顯示：脂肪誘導條件下細胞表達脂蛋白脂酶和過氧化物酶增殖物激活受體γ。而對照組細胞未顯現(xiàn)出向脂肪細胞分化的任何征象。
　　 結(jié)論：經(jīng)KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增的小鼠中央?yún)^(qū)角膜來源的CSCs具有與間充質(zhì)干細胞相似的表型特征，以及向成骨細胞和脂肪細胞分化的能力。
　　 第三部分小鼠角膜基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液對樹突狀細胞成熟的抑制作用
　　 目的：研究小鼠CSCs培養(yǎng)上清液是否具有抑制脂多糖誘導的DCs成熟的作用。

14、r>　　 方法：通過尼龍毛柱法獲取BALB/c小鼠脾臟來源的T細胞，并通過流式細胞技術(shù)檢測細胞表面標記物CD3以測定T細胞純度。原代小鼠CSCs(105/mL)培養(yǎng)于RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，3d后半量換液，6d后收集培養(yǎng)上清液以備用。在裂解紅細胞后，將由C57BL/6小鼠股骨獲取的骨髓單核細胞培養(yǎng)于含10％FBS以及10ng/mL重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)，2d后全量換液，4d后半量換液，6d

15、后收集懸浮和半貼壁細胞，即為未成熟DCs。通過流式細胞技術(shù)檢測細胞表面標記物CD11c以測定DCs純度。向DCs培養(yǎng)液內(nèi)加入脂多糖（1μg/mL），48h后未成熟DCs可被誘導成熟。為研究CSCs培養(yǎng)上清液對DCs成熟的作用，在DCs成熟過程中，不同濃度的培養(yǎng)上清液(25％、50％)被添加至DCs培養(yǎng)液中。而后，通過流式細胞技術(shù)檢測DCs成熟狀態(tài)標記物CD80、CD86和主要組織相容性抗原Ⅱ類分子(MHC-Ⅱ)，以對DCs的表型成熟狀態(tài)

16、進行鑒定；通過混合淋巴細胞反應檢測DCs刺激T細胞增殖能力以及通過FITC標記葡聚糖內(nèi)吞實驗檢測抗原吞噬功能，以對DCs的功能成熟狀態(tài)進行鑒定。
　　 結(jié)果：小鼠脾臟細胞經(jīng)紅細胞裂解以及尼龍毛柱篩選提取后，可得到大量單個懸浮的小細胞。經(jīng)流式細胞技術(shù)檢測，細胞高表達T細胞標記物CD3(93.97％±3.06％)。小鼠骨髓單核細胞誘導培養(yǎng)6d后，細胞集落明顯，呈懸浮或半貼壁生長。細胞表面可見長短不一的毛刺狀突起，且高表達CD11c(

17、78.61％±4.27％)，低表達CD80、CD86和MHC-Ⅱ。細胞經(jīng)脂多糖刺激48h后，CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達明顯上調(diào)。在DCs成熟過程中，將不同濃度的CSCs培養(yǎng)上清液(25％、50％)添加至DCs培養(yǎng)液后，與對照組相比，DCsCD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達均降低（P＜0.01），CD11c的表達無明顯差異（P＞0.05）；刺激T細胞增殖能力降低（P＜0.05）；抗原吞噬功能增強(P＜0.01)。此外，CSCs

18、培養(yǎng)上清液抑制DCs成熟的作用還呈現(xiàn)出劑量依賴性（25％vs.50％，P＜0.05）。
　　 結(jié)論：小鼠CSCs培養(yǎng)上清液可以抑制脂多糖誘導的DCs表型以及功能成熟，且呈劑量依賴性。因此，我們推測CSCs可以通過分泌可溶性免疫調(diào)節(jié)因子抑制DCs成熟。
　　 第四部分小鼠角膜基質(zhì)細胞通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β2以及前列腺素E2抑制樹突狀細胞成熟
　　 目的：探索小鼠CSCs是否通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)、

19、前列腺素E2(PGE2)、白介素10(1L-10)以及巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)抑制DCs成熟。
　　 方法：采用RT-PCR檢測原代小鼠CSCsTGF-β2、IL-10、M-CSF以及前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)等基因的表達情況。據(jù)此，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定CSCs培養(yǎng)上清液以及新鮮RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)PGE2和TGF-β2的含量。而后，通過應用TGF-β2中和抗體（15μg/mL）以及P

20、GE2受體阻滯劑AH6809（100μmol/L），對CSCs是否通過分泌TGF-β2以及PGE2抑制DCs成熟作進一步鑒定。在DCs成熟過程中，分別作以下不同處理：1，LPS;2，LPS+50％CSCs培養(yǎng)上清液；3，LPS+50％CSCs培養(yǎng)上清液+AH6809;4，LPS+50％CSCs培養(yǎng)上清液+中和抗體；5，LPS+50％CSCs培養(yǎng)上清液+AH6809+中和抗體。然后，應用流式細胞技術(shù)檢測DCsCD11c、CD80、CD86

21、和MHC-Ⅱ的表達情況，通過混合淋巴細胞反應檢測刺激T細胞增殖能力，以及通過FITC標記葡聚糖內(nèi)吞實驗檢測抗原吞噬功能。
　　 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果表明：原代小鼠CSCs高表達TGF-β2和PTGS2，低表達M-CSF，不表達IL-10;ELISA數(shù)據(jù)顯示：與新鮮RPMI1640培養(yǎng)基相比，CSCs培養(yǎng)上清液內(nèi)含有較高濃度的TGF-β2（1.46±0.38ng/mL）和PGE2（21.27±0.94ng/mL）。向CSCs培養(yǎng)

22、上清液中加入TGF-β2中和抗體，可以不同程度的逆轉(zhuǎn)CSCs培養(yǎng)上清液對DCs表型以及功能成熟的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。使用AH6809預處理未成熟DCs同樣可以不同程度的逆轉(zhuǎn)CSCs培養(yǎng)上清液對DCs功能成熟的抑制作用(P＜0.05)，以及對CD86和MHC-Ⅱ表達的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，但不能逆轉(zhuǎn)對CD80表達的抑制作用（P＞0.05）。同時應用TGF-β2中和抗體以及AH6809，可以提高DCsM