1、目的:Toll樣受體4(TLR4)是內(nèi)毒素(LPS)的關(guān)鍵受體,為Toll蛋白家族中的一個(gè)成員,是聯(lián)系固有免疫和適應(yīng)性免疫的紐帶。TLR4主要表達(dá)于髓源性細(xì)胞,其啟動(dòng)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在肝損傷的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。核因子-KB(NF-κB)是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能與多種細(xì)胞基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合,通過(guò)調(diào)控多種重要的細(xì)胞因子、粘附分子和趨化因子的表達(dá),在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的

2、生長(zhǎng)調(diào)控等方面發(fā)揮重要的作用,其活化也參與細(xì)胞增殖和凋亡的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型,動(dòng)態(tài)觀察TLR4和NF-κB在肝組織中的表達(dá)情況,探討免疫炎癥機(jī)制在2型糖尿病肝臟病變中的作用。
　　 方法:將清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組),胰島素抵抗組(IR組),糖尿病4周組(DM4w組)和糖尿病8周組(DM8w組),均普通飼料喂養(yǎng)。IR組、DM4w組、DM8w三組連續(xù)7周按1ml/100mg體重/d給

3、予脂肪乳灌胃,NC組按同樣劑量給予水灌胃對(duì)照。第7周末測(cè)定血糖及胰島素,計(jì)算并比較各組胰島素水平,顯示脂肪乳灌胃組(即IR、DM4w、DM8w組)胰島素高于NC組。遂于次日清晨稱取動(dòng)物體重,按30mg/kg體重尾靜脈注射STZ。3天后,血糖測(cè)定結(jié)果大于16.7mmol/l為2型糖尿病造模成功。造模后繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)和脂肪乳灌胃(0.5ml/100mg體重/d)。動(dòng)物處死前股動(dòng)脈取血,測(cè)定空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FPG)、糖化血

4、清蛋白(GSP)、血脂等生化指標(biāo)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定大鼠肝臟組織胰島素受體,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)大鼠肝臟組織TLR4 mRNA的表達(dá),免疫組化測(cè)定肝臟組織中NF-κB蛋白的表達(dá)。所得數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。
　　 結(jié)果:高糖高脂飲食7周后,與對(duì)照組相比,脂肪乳灌胃三組血清胰島素升高明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ISI明顯降低,HOMA-IR明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；STZ誘導(dǎo)后,2型

5、糖尿病大鼠全部成模。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),大鼠的ALT、AST、GSP于NC組、IR組、DM4w組、DMSw組中遞增,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DM4w組和DM8w組的FBG、TG、TC高于NC組和IR組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NC組比較,其他3組的FINS、LDL-c、FFA均高于NC組,而HDL-c均低于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA法測(cè)定大鼠肝臟組織胰島素受體水平結(jié)果示,與NC組比較,IR組、DM4w組、DM8w組大鼠肝細(xì)胞膜胰島素受體水平升高

6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； RT-PCR檢測(cè)大鼠肝臟組織TLR4 mRNA的表達(dá)結(jié)果示,TLR4 mRNA表達(dá)水平于NC組、瓜組、DM4w組、DM8w組中遞增,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化測(cè)定肝臟組織中NF-κB蛋白的表達(dá)結(jié)果示,NF-κB蛋白的表達(dá)水平亦于NC組、瓜組、DM4w組、DM8w組中遞增,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pearson相關(guān)分析示,TLR4 mRNA與NF-κB蛋白表達(dá)、ALT、AST均呈正相關(guān)。NF-κB蛋白表達(dá)與ALT、AST呈正相關(guān)

7、。
　　 結(jié)論:
　　 (1)脂肪乳灌胃(高糖高脂飲食)7周加小劑量一次尾靜脈注射STZ可以成功誘導(dǎo)SD大鼠的2型糖尿病模型,方法可靠,可全部成模；
　　 (2)胰島素抵抗和2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞膜上的胰島素受體數(shù)目增多,可能與胰島素敏感性及作用下降有關(guān)；
　　 (3)隨著糖尿病的進(jìn)展,肝臟組織中TLR4及NF-κB的表達(dá)水平增加,且與肝臟組織的損害呈正比,證實(shí)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的炎癥反應(yīng)在2型糖