1、目的：近年來(lái)糖尿病的發(fā)生率逐年遞增，由此導(dǎo)致的腎臟損害也逐年增加。糖尿病腎臟損害的機(jī)制目前尚不是很清楚，闡明糖尿病導(dǎo)致腎臟損害的發(fā)生機(jī)理對(duì)于探索其防治措施具有重要的臨床意義。近年研究顯示，由營(yíng)養(yǎng)物過(guò)剩所誘導(dǎo)的代謝性炎癥(metabolic inflammation)在代謝性疾病腎臟損害中可能起重要作用。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的受體之一，外界微生物可與TLRs結(jié)合并激活固有免疫

2、、炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)。近年發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)源性配體也可與TLRs結(jié)合，激活炎癥反應(yīng)。但目前對(duì)于TLRs系統(tǒng)與糖尿病腎損傷發(fā)生之間的關(guān)系研究較少，僅限于TLR2和TLR4，對(duì)于整個(gè)TLRs系統(tǒng)在糖尿病腎臟損害中的作用目前國(guó)際上并未進(jìn)行系統(tǒng)地研究。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子14(Kruppel-like factors14，KLF14)是調(diào)控能量代謝的轉(zhuǎn)錄因子，全基因組關(guān)聯(lián)分析表明該基因可能與Ⅱ型糖尿病有關(guān)，但是對(duì)其在糖尿病腎損傷

3、中的作用還不清楚。近年來(lái)，雖然已經(jīng)用大鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物建立了糖尿病模型，試圖研究糖尿病及其腎損害的發(fā)生機(jī)制，但是由于嚙齒類(lèi)動(dòng)物與人類(lèi)存在較大差異，其研究結(jié)果并不能很好地模擬人類(lèi)疾病的發(fā)生過(guò)程。與其他動(dòng)物相比，人和小型豬在生理、病理、解剖、代謝作用等方面非常相似，并且與其他大型動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物相比，小型豬在倫理學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)方面具有更大優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)小型豬作為一種大動(dòng)物已經(jīng)被用來(lái)建立多種人類(lèi)疾病模型。小型豬腎臟功能及解剖結(jié)構(gòu)和人相似，大小和形狀也

4、和人相似。另外，小型豬和人類(lèi)一樣是雜食動(dòng)物，因此，用小型豬作為大動(dòng)物模型研究人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)代謝疾病具有極大的優(yōu)勢(shì)。本研究中，我們首先在高糖高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小型豬模型中，系統(tǒng)地研究了固有免疫TLRs系統(tǒng)及其誘導(dǎo)的代謝性炎癥反應(yīng)在糖尿病腎臟損害中的作用，然后構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pCAG-KLF14擬建立糖尿病小型豬模型，以明確TLRs系統(tǒng)和KLF14在糖尿病腎臟損害中的作用機(jī)制。
　　 方法：小型豬共24頭，隨機(jī)分為兩組:(1)正常對(duì)

5、照組(CON)6只:喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料。(2)糖尿病組(DM)18只:喂養(yǎng)高糖高脂飼料（由51％基礎(chǔ)飼料、2％的膽固醇、29％蔗糖、10％豬油組成）。飼喂周期為24個(gè)月。喂養(yǎng)過(guò)程中每2個(gè)月取血一次，測(cè)定生化指標(biāo)（血糖、胰島素、胰高血糖素、肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）;PAS觀(guān)察腎臟病理變化;用免疫組化和免疫熒光觀(guān)察巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68; Western Blot檢測(cè)內(nèi)源性配體HSP70和HMGB1;用Wes

6、tern Blot檢測(cè)MyD88依賴(lài)性通路TLRs(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11)及其下游信號(hào)通路銜接分子MyD88和蛋白激酶Phospho-IRAK-1;用免疫組化觀(guān)察TLR2、TLR4; Western Blot檢測(cè)MyD88非依賴(lài)性通路分子TLR3、TLR4及其下游信號(hào)通路蛋白激酶Phospho-IRF-3;用Western Blot檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路分

7、子(Phospho-IKKβ、Phospho-Iκ Bα、NF-κB p65和Phospho-NF-κB p65);用qRT-PCR檢測(cè)腎組織中炎癥因子IL-6、MIP-2、MCP-1、CCL5、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平。對(duì)于pCAG-KLF14轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建，通過(guò)提取小型豬腎臟總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR獲得目的基因、構(gòu)建pEASY T1-KLF14克隆載體、測(cè)序、酶切回收、構(gòu)建pCAG-KLF14真核表達(dá)載體。

8、　　 結(jié)果：血生化檢測(cè)表明在糖尿病模型組，血糖與胰島素顯著升高(P＜0.05)，而胰高血糖素未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);膽固醇、低密度脂蛋白水平顯著升高(P＜0.05)，甘油三酯、高密度脂蛋白無(wú)明顯變化(P＞0.05)。腎臟PAS顯示，糖尿病組腎小球明顯肥大、腎小管直徑變大。免疫組化和免疫熒光顯示，糖尿病組腎臟組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68表達(dá)增加。糖尿病組腎臟組織中內(nèi)源性配體HSP70表達(dá)增加。糖尿病組腎臟組織中參與MyD88依賴(lài)

9、性通路的TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR11及其下游信號(hào)通路銜接分子MyD88、蛋白激酶Phospho-IRAK-1表達(dá)均增加，TLR1、TLR6、TLR9、TLR10沒(méi)有顯著變化;參與MyD88非依賴(lài)性通路的TLR3、TLR4及其下游信號(hào)通路蛋白激酶Phospho-IRF-3表達(dá)均增加。糖尿病組腎臟組織中NF-κB信號(hào)通路分子（Phospho-IKKβ、Phospho-Iκ Bα、NF-κB p65和Phosp

10、ho-NF-κB p65）表達(dá)均增加。糖尿病組腎臟組織中炎癥因子IL-6、MIP-2、MCP-1、CCL5、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高。另外，我們成功構(gòu)建了pCAG-KLF14轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，擬用該重組表達(dá)載體通過(guò)核移植技術(shù)制備糖尿病轉(zhuǎn)基因小型豬模型。
　　 結(jié)論：結(jié)果表明，在糖尿病小型豬模型腎臟中，內(nèi)源性配體HSP70、固有免疫系統(tǒng)TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR11以及TLR3、TLR4的