1、偽狂犬病毒(pseudorabies vims，PRV)是引起多種家畜和野生動物偽狂犬病的病原體。PRV屬皰疹病毒科，a皰疹病毒亞科，基因組為約150 kb的線性雙鏈DNA。PRV具有宿主范圍廣、不感染人、可供外源基因插入或替代的非必需基因位點多以及插入外源基因容量大等特點，在構建動物病毒載體方面具有明顯優(yōu)勢。缺失PRV毒力基因，將外源保護性抗原基因插入PRV基因組表達，構建基因工程缺失疫苗和多價疫苗是目前偽狂犬病防治研究的熱點。目前P

2、RV疫苗存在的一個問題就是，盡管可以抑制疾病的爆發(fā)，但是不能抵抗病毒的感染，所以免疫之后的家畜仍然可以攜帶并傳播病毒。這主要是由于PRV在長期的進化過程中形成了多種逃避宿主免疫系統(tǒng)的機制。研究發(fā)現(xiàn)，作為疫苗開發(fā)中主要抗原的gB和gD蛋白在病毒免疫逃逸過程中具有重要的促進作用，這包括兩個方面：(1)gB和gD都可以促進抗體誘導的細胞表面的病毒糖蛋白的內吞作用；(2)gB還促進了病毒在細胞間的直接傳播。上述功能的發(fā)揮與其胞內區(qū)含酪氨酸的基序

3、YXXФ密切相關，該結構的突變可使其喪失以上功能。另外，PRV也是皰疹病毒的—個重要模式病毒。PRV功能基因組學的研究對理解皰疹病毒復制和致病的機理具有重要意義。然而，由于皰疹病毒結構非常復雜，對其進行系統(tǒng)的遺傳學研究相當困難。細菌人工染色體(bacterial artificialchromosome，BAC)技術為皰疹病毒等的遺傳學研究開辟了新的道路，使得對病毒基因組進行系統(tǒng)的遺傳學分析成為可能。盡管如此，含有皰疹病毒的基因組的BA

4、C往往很大，不能采用酶切、連接等常規(guī)的技術操作，所以基因工程改造仍然相當困難。 本研究分為以下三個方面： 首先，為了構建PRVTK-/GFP突變體，首先提取偽狂犬病毒(PRV)湖北株基因組DNA為PCR擴增模板，并根據GenBank已發(fā)表的基因序列，選擇保守序列設計了兩對引物，分別擴增出位于UL23分別擴增出位于UL23即胸苷激酶(Thymidine Kinase TK)兩側(含部分TK基因)的可用于同源重組的上游同源臂

5、和下游同源臂，上游同源臂長度為1781bp包括部分UL25、全部UL24、部分TK，下游同源臂長度為包括部分TK及部分UL22，上游同源臂和下游同源臂的拼接片段中TK基因內部缺失842個核苷酸。將兩個同源臂克隆于pBluescriptSK+載體上，獲得pSK-1781-1968；再將綠色熒光蛋白載體pEGFP-N1上含GFP完整的基因表達盒插入pSK-1781-1968的上游同源臂和下游同源臂之間構成轉移載體pSKAaXG。提取pSKA

6、aXG質粒，經單酶切線性化后用脂質體轉染BHK21細胞，轉染24h后，再以10MOI的野生型PRV進行感染。過夜培養(yǎng)之后在細胞培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)篩選的重組病毒。最后通過蝕斑純化獲得PRVTK-/GFP突變株。依據缺失區(qū)域兩側序列設計引物，PCR結果證實了TK的缺失與GFP表達盒的插入。這為進一步開發(fā)病毒疫苗載體提供了基礎。 其次，為了研究gB和gD胞內區(qū)YXXФ基序的功能以及對這兩種抗原免疫效果的影響，首先

7、設計兩對引物分別擴增出PRV湖北株的gB和gD基因，并克隆到真核表達載體pcDNA3.1+上。測序結果顯示gB基因全長為2751 bp編碼916個氨基酸，gD基因全長為1209 bp編碼402個氨基酸。然后依據測序結果，再設計針對胞內區(qū)YXXФ中基序的突變引物，通過PCR或重疊PCR獲得gB和gD基因的YXXФ基序突變體，并將各突變體克隆到pcDNA3.1+上。通過酶切和測序證實獲得了與預期相同的突變體。這為進一步研究gB，gD YXX

8、Ф基序在免疫逃逸中的作用，以及開發(fā)更加有效的疫苗奠定了基礎。 最后，為了利用Tn7介導的轉座快速構建重組PRV，首先設計兩對引物，分別擴增出上游同源臂和下游同源臂，克隆至pBluescript SK+載體匕，然后將lacZ α-mini-attTn7插入兩同源臂之間，獲得轉移載體。在大腸桿菌內，通過同源重組將lacZ α-mini-attTn7插入偽狂犬病毒(PRV)細菌人工染色體(BAC)gG與gD基因間的非轉錄區(qū)，獲得重組B

9、AC pBeckerZF1。測序結果顯示lacZ α-mini-attTn7插入位點位于gG基因的polyA轉錄終止信號下游44 bp，以及gD基因的TATA轉錄起始信號上游23 bp處，不造成任何病毒基因和功能元件的破壞。然后利用Tn7介導的轉座將綠色熒光蛋白基因導入pBeckerZF1的mini-attTn7位點獲得了pBeckerZF2。通過轉染將pBeckerZF1和pBeckerZF2分別導入PK15細胞獲得重組病毒vBeck