1、目的：構(gòu)建pMD18-T-CK20重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，利用Taqman探針技術(shù)，建立一種簡便、快速、靈敏和特異的實(shí)時(shí)熒光定量檢測尿CK20方法，用于膀胱移行細(xì)胞癌（transitional cell carcinoma of bladder，TCCB）早期診斷、預(yù)后及復(fù)發(fā)監(jiān)測。 方法：1.培養(yǎng)膀胱癌T24細(xì)胞株，擴(kuò)增CK20基因片段，并克隆入T-A載體構(gòu)建pMD18-T-CK20重組質(zhì)粒作為定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，用酶切、PCR、測序鑒定

2、。2.設(shè)計(jì)針對CK20基因的引物和Taqman探針，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR or FQ-PCR）CK20檢測方法，探討最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，并進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)（包括線性范圍、靈敏度、特異性、重復(fù)性）。3.將本法初步用于臨床，檢測60例TCCB患者、20例泌尿系非惡性腫瘤患者和15例健康志愿者尿CK20 mRNA表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行尿脫落細(xì)胞學(xué)HE染色檢測。 結(jié)果： 1.標(biāo)準(zhǔn)品制備：成功構(gòu)建重組質(zhì)粒p

3、MD18-T-CK20，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定與預(yù)期結(jié)果一致，符合定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品要求。 2.定量PCR方法建立及評價(jià)：①實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩步法的最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 sec，51℃退火70 sec；最適反應(yīng)體系為：總體積25μl：10×PCR buffer：2.5μl，MgCl2（25mmol/l）：3.5μl，dNTPs（2.5mmol/l）：2μl，Taq（5U/μl）：0.35μl，

4、正義、反義引物（10pmol/μl）均為：2.2μl，Taqman探針（10pmol/μl）：2.2μl，cDNA：2μl，滅菌蒸餾水：8.05μl。②方法學(xué)評價(jià)：該法線性范圍較寬（102～109copies/μl），靈敏度高（102 copies/μl）、特異性好，重復(fù)性好（批內(nèi)CV值為1.59％；天間CV值為2.34％）。 3.初步臨床應(yīng)用：①該法檢測60例TCCB患者，以CT值為30為診斷閾值，靈敏度為85％（51/60）

5、，高于尿脫落細(xì)胞學(xué)HE染色46.7％（28/60）；特異性為94.3％（33/35），尿脫落細(xì)胞學(xué)特異性為100％，兩方法檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。②TCCB組CK20表達(dá)（Mean27712.95copies/ul）大于泌尿系非惡性腫瘤組（Mean74.72copies/ul）和健康志愿者組（Mean8.61 copies/ul），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。③TCCB組按G1、G2、G3分級CK20表達(dá)分別為（

6、Mean21680.5、30985.82、36333.89 copies/ul），G1和G2級差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.016）；按Tis/Ta、T1-2、T3-4分期CK20表達(dá)分別為（Mean20672.16、29213.19、35585.63 copies/ul），Tis/Ta和T1-2期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.022）。 結(jié)論：所建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法操作簡單、靈敏度高、特異性好、結(jié)果數(shù)據(jù)化，適合臨床實(shí)驗(yàn)室用于尿C