1、背景：21三體綜合征又稱為唐氏綜合征（Down’s syndrome,DS）或先天愚型，是常見的由常染色體變異導致中至重度智力障礙等多種臨床表現的疾病。在我國該病的發(fā)生率占出生人數的1/600～1/800，占受孕人數的1/150。由于該病的基因表達的復雜性、表型的多樣性以及個體間的差異，使該疾病的發(fā)病機制一直未能被完全解釋。誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells or iPSCs）是一類將特定轉錄因

2、子導入分化成熟的體細胞后使其發(fā)生重編程而形成的具有多能性的干細胞。特異疾病的iPSCs研究很大程度地保留了成體細胞基因組的遺傳信息，并且iPSCs能通過細胞分裂維持細胞數量，為疾病的研究提供了真實的體外細胞模型并解決了疾病研究的細胞供源問題。iPSCs同時具有向各類型組織細胞分化的潛能，其分化為特定的靶細胞可為特異疾病發(fā)病機制的研究提供標本和完整的發(fā)育模型，為研究DS等染色體疾病提供了一種新的有利的工具。
　　目的：建立羊水細胞及

3、皮膚成纖維細胞來源的21三體誘導多能干細胞系（Trisomy21 human amniotic fluid induced pluripotent stem cells,T21 hAF-iPSCs and Trisomy21 human dermal fibroblasts induced pluripotent stem cells,T21 hDF-iPSCs），比較兩種細胞來源的建系效率，為疾病的機制研究提供理想細胞模型，同時研究2

4、1三體綜合征誘導多能干細胞從全能性細胞向神經細胞誘導分化的過程。
　　方法：⑴利用慢病毒介導4種轉錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）分別誘導建立了羊水細胞及患兒皮膚成纖維細胞來源的21三體綜合征誘導多能干細胞系，并通過堿性磷酸酶染色、免疫熒光染色、qPCR檢測基因表達等方法鑒定其多能性。⑵利用EB懸浮培養(yǎng)法對細胞進行體外分化，用PCR檢測各胚層特有基因的表達情況，并各取1×107個T21-iPSCs注射到SCID小

5、鼠皮下，6周后得到畸胎瘤，行HE染色，觀察iPSCs在體內的分化情況。⑶T21-iPSCs每傳10代重復一次核型分析，檢測T21-iPSCs遺傳性狀的穩(wěn)定情況。⑷1×105個感染后的兩種來源細胞接種在飼養(yǎng)層上，比較出現克隆的時間長短；在25天進行堿性磷酸酶染色，得到出現陽性克隆的效率并進行統(tǒng)計學分析。⑸對T21-iPSCs及正常人iPSCs利用EB誘導法進行體外神經干細胞的誘導分化，進行免疫熒光染色并比較陽性率；獲得神經干細胞后添加特定

6、細胞因子進一步誘導其向神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞分化，進行免疫熒光染色并通過特異蛋白陽性表達來比較分化效率。
　　結果：①分別建立了羊水細胞及皮膚成纖維細胞來源的21三體綜合征的誘導多能干細胞系，通過免疫熒光染色發(fā)現胚胎干細胞特異性表面抗原Oct4、Nanog、TRA-1-60、SSEA-4染色陽性；qPCR檢測的T21-iPSCs內源性多能性基因Nanog、Oct4已被激活，與正常人ES細胞表達水平相似；在持續(xù)傳代過程中

7、細胞形態(tài)學表現穩(wěn)定，核型檢測發(fā)現T21-iPSCs在傳代過程中能維持異常核型；畸胎瘤實驗發(fā)現T21-iPSCs形成的畸胎瘤可分化為三個胚層。②約1×105個感染后的兩種類型細胞接種在飼養(yǎng)層上，羊水細胞在5-7天時出現了胚胎干細胞樣的克隆，而皮膚成纖維細胞在13-15天出現克隆。在25天進行堿性磷酸酶染色，羊水細胞來源的得到285個陽性克隆，效率為0.285％。皮膚成纖維細胞得到27個克隆，效率為0.027%。經X2檢驗P<0.05，誘導

8、羊水細胞與皮膚成纖維細胞形成多能性干細胞的效率差異有統(tǒng)計學意義。③對T21-iPSCs進行神經誘導分化，T21-iPSCs與正常人iPSCs體外分化神經干細胞免疫熒光結果顯示Nestin、Pax6呈陽性，比較誘導效率無顯著差異。繼續(xù)將神經干細胞誘導分化為三種神經細胞系，細胞免疫熒光檢測結果顯示三種神經細胞系的表面標志Tuj1、GFAP和O4的表達為陽性。在分化成神經元和神經膠質細胞的效率方面，T21-iPSCs與對照組相比無顯著差異。<