1、Z h e j i a n g A g r i c ／d t u r e & F o r e s t r y U n i v e r s i t yM a s t e r D e g r e e T h e s i sG e n e E x p r e s s i o n & R e g u l a t i o n o f D a u e r R e l a t e dG e n e s ，a k t - 1a n d

2、d a f - 8 i nP i n e w o o d N e m a t o d e ，B u r s a p h e l e n c h u s x y l o p h i l u sC a n d i d a t e ：J i J i n g - j i n gA d v i s e r ：H u J i a —f u ，A s s o c i a t eP r o f e s s o rY u H o n g - s h i

3、，P r o f e s s o rS p e c i a l t y ：M i c r o b i o l o g yD a t e o f S u b m i s s i o n ：J u n e ，2 0 1 7Z h e j i a n g A & F U n i v e r s i t yL i n ’a n ，Z h e j i a n g p r o v i n c e ，P ．R ．C h i n aJ u n

4、e ，2 0 1 7Ⅲ8 ㈣2 Ⅲ4 j j j Ⅱ■I ㈣0 洲3 ?3 眥Y摘要摘要松材線蟲在環(huán)境不利條件下形成d a u e r 型幼蟲，這種d a u e r 型幼蟲能夠感受傳媒昆蟲——松墨天牛蛹的存在，向其蛹室聚集并附著在天牛體內(nèi)，當松墨天牛蛹羽化為成蟲之后，松材線蟲便借助天牛的飛行移動實現(xiàn)寄主轉(zhuǎn)移，從而引起病害的傳播和流行。目前，科學界對松材線蟲d a u e r 型幼蟲的形成機制尚不清楚，這也為阻止松材線蟲d a u e

5、r 型幼蟲形成和切斷病害流行等特異性的防控技術(shù)設(shè)置了障礙。因此，本文選擇了兩個與松材線蟲d a u e r 型幼蟲形成相關(guān)的基因a k t - 1 和d a f - 8 ，采用實時定量P C R( q P C R ) 、原位雜交( i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ) 和顯微注射( m i c r o i n j e c t i o n ) 等現(xiàn)代分子技術(shù)，系統(tǒng)研究其時空表達特性，并采用R N

6、A 干擾( R N A i ) 技術(shù)研究這兩個基因在松材線蟲d a u e r 型幼蟲形成過程中的調(diào)控功能，以期為揭示松材線蟲D a u e r 型幼蟲的形成機理提供基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：1 ．q P C R 分析結(jié)果顯示，a k t 一』和d a f - 8 基因的表達變化具有高度的一致性，即從胚胎到L 2 表達量顯著增加，L 2 時的表達量最高，隨后逐步下降。這表明a k t —J 和d a f - 8基因可能在松材線蟲d a u

7、 e r 形成之前的L 2 期啟動了i n s u l i n ／I G F 一1 信號路徑和T G F ．B 信號路徑，在一定程度上抑制d a u e r 型幼蟲的形成。另外，成蟲期a k t 一』和d a f - 8 基因在不同性別蟲體內(nèi)的表達量差異顯著，雄蟲明顯高于雌蟲，表明a k t - I和d a f - 8 基因的表達存在性別差異性。2 ．根據(jù)q P C R 定量分析結(jié)果，結(jié)合d a u e r 型幼蟲的關(guān)鍵發(fā)育時間節(jié)點，我

8、們選擇L 2幼蟲開展m R N A 整體原位雜交實驗。研究結(jié)果表明，a k t - 1 基因在松材線蟲L 2 幼蟲身體中部的消化系統(tǒng)穩(wěn)定表達，d a f - 8 基因在中食道球及其后部穩(wěn)定表達。根據(jù)該原位雜交的特異性表達部位，結(jié)合松材線蟲d a u e r 型幼蟲的口針和食道嚴重退化的形態(tài)特征，進一步證實a k t —J 和d a f - 8 基因可能是調(diào)控松材線蟲d a u e r 型幼蟲形成的關(guān)鍵基因。3 ．采用I n —f u s