1、第一部分、NOXIN在肝癌中作用和機(jī)制研究
　　目的：基因組DNA拷貝數(shù)的變化是人類惡性疾病，特別是惡性腫瘤的標(biāo)志之一。但是，到底何種原癌基因或抑癌基因DNA拷貝數(shù)的變化引起了肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展尚不確定。本研究中，我們?cè)噲D通過(guò)對(duì)人肝癌樣本DNA拷貝數(shù)分析來(lái)發(fā)現(xiàn)伴隨DNA拷貝數(shù)變異的新的潛在的原癌基因或抑癌基因。
　　方法：我們采用單核苷酸多態(tài)性全基因組水平DNA拷貝數(shù)分析來(lái)研究人肝癌樣本的DNA拷貝數(shù)的變化。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合

2、酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining,IHC)的方法評(píng)價(jià)了肝癌組織樣本中NOIXN基因的表達(dá)水平。對(duì)肝癌細(xì)胞株過(guò)表達(dá)或干擾NOXIN基因的表達(dá)后，我們分別通過(guò)生長(zhǎng)曲線、平板克隆形成、軟瓊脂克隆形成評(píng)價(jià)NOXIN基因?qū)Ω伟┘?xì)胞株生長(zhǎng)能力的影響，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、trans-well實(shí)驗(yàn)

3、評(píng)價(jià)了NOXIN基因?qū)Ω伟┘?xì)胞株遷移能力的影響，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)價(jià)了NOXIN基因?qū)Ω伟┘?xì)胞株細(xì)胞周期的影響，通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了NOXIN基因?qū)Ω伟┘?xì)胞株體內(nèi)成瘤能力的影響，通過(guò)免疫共沉淀(Reciprocal co-immunoprecipitation,Co-IP)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了NOXIN蛋白與DNA聚合酶α之間的相互作用，通過(guò)免疫熒光(immunofluorescence,IF)評(píng)價(jià)了NOXIN蛋白肝癌細(xì)胞株中的定位情況。結(jié)果

4、：通過(guò)對(duì)人43對(duì)肝癌組織樣本全基因組水平DNA拷貝數(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)最小擴(kuò)增區(qū)，其中包括我們的研究對(duì)象NOXIN基因。NOXIN基因表達(dá)上調(diào)與肝細(xì)胞肝癌的腫瘤分級(jí)顯著相關(guān)。過(guò)表達(dá)NOXIN基因促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤形成，而RNA干擾NOXIN基因的表達(dá)分別抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤形成。有趣的是，通過(guò)Brdu摻入實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)NOXIN基因過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株DNA從頭合成從而促

5、進(jìn)了細(xì)胞周期G1向S期的轉(zhuǎn)化。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NOXIN蛋白與DNA聚合酶α之間相互作用，提示NOXIN基因可能是通過(guò)促進(jìn)了DNA聚合酶引物酶復(fù)合體的形成從而促進(jìn)了DNA的從頭合成。
　　結(jié)論：基因組水平DNA擴(kuò)增增加促進(jìn)了NOXIN基因的過(guò)表達(dá)，從而通過(guò)促進(jìn)DNA合成與細(xì)胞周期進(jìn)程加快促進(jìn)了肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展。在此過(guò)程中，NOXIN蛋白通過(guò)與DNA聚合酶α的相互作用發(fā)揮作為DNA聚合酶引物酶復(fù)合體共分子的功能。
　　第二

6、部分LZP對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝影響研究
　　目的：脂肪肝與肝癌嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康，二者常常伴隨發(fā)生。部分脂肪肝患者可以發(fā)展成脂肪性肝炎，進(jìn)而導(dǎo)致肝癌發(fā)生，但其分子機(jī)制不清除。有意義的是本課題組發(fā)現(xiàn)和鑒定的LZP(Liver specific ZP domain containing protein)基因在肝癌表達(dá)普遍且顯著下降，而LZP基因剔出小鼠顯示肝臟脂肪沉積，脂質(zhì)代謝紊亂，提示LZP缺乏導(dǎo)致脂肪肝，進(jìn)而可能影響肝癌發(fā)生、發(fā)展。本

7、研究擬基于LZP基因剔出小鼠模型結(jié)合人肝癌樣本和細(xì)胞研究LZP在肝臟脂質(zhì)代謝過(guò)程中的作用、其缺乏對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展的影響及其分子機(jī)制;在此基礎(chǔ)上，探討LZP或者相關(guān)致癌分子機(jī)制作為靶向防治肝癌策略的可行性。
　　方法：通過(guò)對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的檢測(cè)評(píng)價(jià)LZP對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)的影響，通過(guò)組織學(xué)檢查評(píng)價(jià)LZP對(duì)肝臟形態(tài)學(xué)的影響，通過(guò)免疫組化和免疫熒光評(píng)價(jià)LZP在肝臟細(xì)胞中的定位，通過(guò)免疫印跡評(píng)價(jià)LZP是否分泌及對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的影響，

8、通過(guò)免疫共沉淀評(píng)價(jià)LZP與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互作用。
　　結(jié)果：血液生化指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外周血甘油三酯（TG）含量下降。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞空泡化增加，油紅染色深染增加，血清和肝臟勻漿液中脂質(zhì)定量分析發(fā)現(xiàn)，肝臟中甘油三酯增加，血清中甘油三酯下降。免疫組化和免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LZP蛋白主要定位于細(xì)胞交界處，免疫印跡發(fā)現(xiàn)LZP可分泌與細(xì)胞培養(yǎng)上清中。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，LZP蛋白表達(dá)增加可以增加脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ApoB含量，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)LZP與脂