1、目的：
　　 1.構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶KDELC1新基因的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行純化，制備融合蛋白多克隆抗體。
　　 2.明確該糖基轉(zhuǎn)移酶在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位及組織分布。
　　 3.探討KDELC1表達(dá)變化對(duì)HepG2細(xì)胞周期可能的調(diào)節(jié)作用。
　　 4.探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中該蛋白表達(dá)變化特征。
　　 5.探討該蛋白在肝細(xì)胞損傷中的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：
　　 1.克

2、隆、表達(dá)KDELC1融合蛋白。
　　 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription PCR，RT-PCR）技術(shù)，以人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（HepG2細(xì)胞）為模板提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，擴(kuò)增目的基因KDELC1的全長(zhǎng)CDs，并將其克隆至pGEM-T-EASY載體，測(cè)序驗(yàn)證。隨后將KDELC1全長(zhǎng)片段插入原核表達(dá)載體pET-32a（+）中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)

3、，分別通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法和免疫印跡（Western blot）法，分析驗(yàn)證融合蛋白表達(dá)的特異性。隨后大量誘導(dǎo)該蛋白表達(dá)，利用親和層析法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化。
　　 2.制備KDELC1的多克隆抗體。
　　 以純化的融合蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體。同時(shí)以免疫前后的兔血清作為一抗，利用Western blot技術(shù)和ELISA方法對(duì)多克隆抗體進(jìn)行特異性分析和效價(jià)檢測(cè)。
　　 3

4、.構(gòu)建KDELC1細(xì)胞內(nèi)定位載體。
　　 擴(kuò)增KDELC1全長(zhǎng)CDs，將全長(zhǎng)片段插入至綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，分別用雙酶切、測(cè)序進(jìn)行鑒定，從而構(gòu)建KDELCl與綠色熒光蛋白基因真核共表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-KDELC1。隨后利用已構(gòu)建的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)居民蛋白calreticulin定位質(zhì)粒pERFP-calrrticulin-N1，共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，利用激光共聚焦顯微術(shù)，觀察分析KDELC1在細(xì)胞內(nèi)的分布特征

5、。
　　 4.分析KDELC1在組織中的分布特征。
　　 利用上述制備成功的KDELC1多克隆抗體，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察分析KDELC1在肝臟、肺、腎臟、脾臟、胃、乳腺、淋巴結(jié)、直腸組織中的分布特征。
　　 5.構(gòu)建、篩選KDELC1干擾質(zhì)粒。
　　 委托Inventrogen公司，構(gòu)建KDELC1干擾質(zhì)粒。將多對(duì)KDELC1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，48小時(shí)后收獲細(xì)胞，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，通過

6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）技術(shù)篩選出有效序列（pcDNA6.2-GW/EMG-FP mir-KDELC1 shRNA）。
　　 6.分析KDELC1表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　 分別利用pEGFP-C1-KDELC1和pcDNA6.2-GW/EMGFPmir-KDELC1-shRNA載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，調(diào)節(jié)KDELC1的表達(dá)，利用流式細(xì)胞儀分析KDELC1高表達(dá)和低表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響。<

7、br>　　 7.初步探討KDELC1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用。
　　 利用衣霉素刺激HepG2細(xì)胞，建立細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。分別利用Western blot、real-time PCR法，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中KDELC1蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)變化情況。
　　 8.初步探討KDELC1在臨床肝損傷中的作用。
　　 收集臨床肝功能異常血清標(biāo)本及正常對(duì)照血清標(biāo)本，利用ELISA技術(shù)包被酶標(biāo)板，采用上述制備的KDEL

8、C1多克隆抗體，分析該蛋白在肝損傷過程中可能的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功獲得KDELC1融合蛋白。
　　 人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2經(jīng)10％小牛血清DMEM培養(yǎng)36h后，Trizol法從HepG2細(xì)胞中提取總RNA。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得HepG2細(xì)胞cDNA。成功構(gòu)建KDELC1的原核表達(dá)載體pET32a（+）-KDELC1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21表達(dá)菌，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確認(rèn)終濃度為

9、1mmol/L的IPTG、30℃、4h可誘導(dǎo)表達(dá)出KDELC1融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)確認(rèn)。
　　 2.成功獲得KDELC1的多克隆抗體。
　　 利用親和層析柱，使用終濃度為10mM咪唑的結(jié)合緩沖液，依次加50％，100％終濃度為150mM的咪唑結(jié)合緩沖液，50％，100％的500m M咪唑結(jié)合緩沖液洗脫層析柱，得到KDELC1的融合蛋白，經(jīng)Western blot、SDS-PAGE驗(yàn)證

10、。將所得KDELC1融合蛋白免疫新西蘭大白兔5次，取其血清，使用蛋白A瓊脂糖層析柱純化KDELC1多克隆抗體，經(jīng)Western blot檢測(cè)證明該抗體有較好的特異性。
　　 3.成功構(gòu)建KDELC1的細(xì)胞內(nèi)定位載體。
　　 分別構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-KDELC1、pERFP-calrrticulin-N1，經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定后，共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。激光共聚焦顯示pEGFP-C1-KDELC1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)居民蛋白

11、calreticulin存在共定位現(xiàn)象。
　　 4.初步了解KDELC1在組織中的分布特征。
　　 利用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，KDELC1高表達(dá)于肝組織，弱表達(dá)于其他組織。胃、直腸以及喉組織較少表達(dá)；弱表達(dá)于腎小管，腎小球及系膜組織表達(dá)較弱。肺組織中度表達(dá)；淋巴結(jié)及脾臟高表達(dá)，主要表達(dá)于生發(fā)中心周圍較成熟的淋巴細(xì)胞。
　　 5.成功構(gòu)建、篩選出KDELC1的干擾質(zhì)粒。
　　 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（rea

12、l-time PCR）技術(shù)成功篩選出shRNA干擾質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EMGFPmir-KDELC1 shRNA（pcDNA6.2-KDELC1 shRNA）。
　　 6.KDELC1的表達(dá)變化參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。
　　 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示KDELC1表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-KDELC1轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞S期顯著顯著增加；而轉(zhuǎn)染KDELC1 RNA干擾質(zhì)粒pcDNA6.2-KDEL C1-RNAi-1后S期顯

13、著降低。
　　 7.KDELC1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。
　　 在衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，KDELC1在蛋白水平和mRNA水平表達(dá)基本一致，不同濃度的藥物組之間蛋白表達(dá)無明顯變化，但與非藥物組相比，KDELC1的表達(dá)有較高程度的上調(diào)。
　　 8.KDELC1與臨床肝損傷有關(guān)
　　 通過ELISA技術(shù)分析，結(jié)果表明KDELC1蛋白在肝功能異常組較正常組表達(dá)明顯增高。
　　 結(jié)論：
　　 1.

14、KDELC1原核表達(dá)融合蛋白分子量75kDa，免疫動(dòng)物制備的KEDLC1的蛋白多克隆抗體具有較高的KEDLC1結(jié)合活性。
　　 2.KEDLC1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)居民蛋白calreticulin蛋白存在共定位關(guān)系，提示KEDLC1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　 3.KEDLC1在肝臟、肺、腎臟、脾臟、胃、乳腺、淋巴結(jié)、直腸組織中均有表達(dá)。
　　 4.KEDLC1參與調(diào)控細(xì)胞周期，高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，低表達(dá)抑制細(xì).胞增殖。