1、1、長效HSA/GH融合蛋白的優(yōu)化設計
　　目前臨床使用的部分蛋白/多肽類藥物由于分子量較小，在人體內的半衰期短，須頻繁注射以維持藥效，從而限制了其臨床應用，如本文研究的人生長激素(humangrowth hormone，hGH)、人甲狀旁腺激素PTH(1-34)(human parathyroid hormone1-34)。人血清白蛋白(HSA)融合技術是延長蛋白/多肽類藥物半衰期的一種簡便、靈活的技術，也是目前國內外生物制藥研

2、究的熱點。在利用HSA融合目的蛋白實現(xiàn)長效的技術研究中，仍有一些基礎問題需要解決。如目前所有報道的HSA融合蛋白的體外生物學活性均有不同程度的降低，說明了HSA對所融合的蛋白/多肽的活性位點的干擾。另外，有報道指出，HSA也有可能會影響所融合蛋白的正確折疊或者糖基化位點的暴露程度，導致重組表達的融合蛋白產(chǎn)物不均一。因此，在HSA融合蛋白的開發(fā)中有必要考察不同融合方向，連接肽的有無和長短對融合蛋白活性、穩(wěn)定性的影響，綜合考慮各種因素，從而

3、選擇一種最優(yōu)選的融合方式。本文著重研究了連接肽的引入和長短對HSA/GH融合蛋白的體外生物學活性和穩(wěn)定性影響，為HSA/GH融合蛋白的開發(fā)提供了一種優(yōu)選設計，同時也為其他HSA融合蛋白的設計提供了參考。
　　2、HSA/GH融合蛋白免疫檢測方法的建立
　　目前市場上只有檢測GH或者HSA的ELISA試劑盒，沒有專門針對HSA/GH融合蛋白的ELISA試劑盒。而在藥代動力學研究中，要檢測到完整的HSA/GH分子才能準確反映HS

4、A/GH在體內的代謝動力學過程。本文建立了一種能夠檢測HSA/GH融合蛋白完整分子的雙抗夾心ELISA，其檢測范圍在2.156～69ng/ml，初步應用于大鼠體內的藥代動力學研究，為HSA/GH融合蛋白進一步的臨床前開發(fā)奠定了基礎。
　　3、HSA融合蛋白的高效畢赤酵母表達系統(tǒng)的建立
　　酵母表達系統(tǒng)兼具了原核表達系統(tǒng)表達周期短、表達量較高、易于工業(yè)化高密度培養(yǎng)的優(yōu)點以及真核表達系統(tǒng)對外源蛋白進行糖基化、磷酸化等翻譯后修飾的

5、特點，被公認為是一種表達大規(guī)模蛋白的強有力工具。研究也表明，酵母表達系統(tǒng)是目前用于HSA重組表達最高效、最經(jīng)濟的一種表達系統(tǒng)，利用畢赤酵母表達一系列HSA融合蛋白具有潛在優(yōu)勢，因此本課題組將畢赤酵母作為首選表達系統(tǒng)，應用于一系列HSA融合蛋白的研究。但在表達一系列HSA融合蛋白時發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)優(yōu)化的畢赤酵母表達系統(tǒng)主要存在兩大缺陷，影響了HSA融合蛋白的高效重組表達，嚴重制約了HSA融合蛋白的臨床前研究進程:1）分泌表達過程中的降解問題;2

6、）分泌表達效率普遍較低，使得發(fā)酵表達量的提升也非常有限。因此有必要對畢赤酵母表達系統(tǒng)進行優(yōu)化，實現(xiàn)HSA融合蛋白的高效表達。
　　3.1構建蛋白酶缺陷型宿主改善HSA融合蛋白的降解
　　一系列HSA融合蛋白在畢赤酵母中表達時都存在不同程度的降解，若與HSA進行融合的蛋白/多肽對蛋白酶敏感，重組表達時的降解問題會更嚴重，更復雜。由于降解條帶一般與完整的HSA融合蛋白性質相近，影響了后續(xù)重組蛋白的純化制備。
　　本文以其中

7、一個典型的易降解蛋白——人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素(1-34)融合蛋白[HSA/PTH(1-34)]為研究對象，首先通過Western Blot、N端氨基酸測序以及質譜分析證明了表達產(chǎn)物中完整蛋白的存在，并對降解產(chǎn)物進行了表征。
　　文獻報道指出，PTH易被酵母中的一類yapsin蛋白酶降解，并且液泡蛋白酶也是導致外源蛋白在畢赤酵母中重組表達時發(fā)生降解的主要原因。畢赤酵母中的液泡蛋白酶已經(jīng)研究的比較清晰，并且已經(jīng)有敲除主要液泡蛋

8、白酶的商品化蛋白酶缺陷型宿主（SMD1168宿主為proteinaseA缺陷型，SMD1163為proteinaseA和proteinase B雙重缺陷型）。根據(jù)畢赤酵母基因組測序結果，畢赤酵母中的yapsin家族共存在7個成員（YPS1，YPS2，YPS3，YPS7，MKC7，YPS'，YPS"），但針對這7個yapsin成員的研究目前相對較少。本文利用同源重組的方法，構建了7個單一YPS敲除的畢赤酵母宿主。通過分析7種單一YPS缺陷

9、宿主和proteinase A，proteinase B缺陷宿主對HSA/PTH(1-34)融合蛋白降解的影響，發(fā)現(xiàn)YPS1敲除和proteinaseA敲除都有助于改善HSA/PTH(1-34)融合蛋白的降解。通過將YPS1和proteinaseA同時敲除，降解得到最大程度的改善，與野生型GS115相比，完整蛋白的產(chǎn)率從30％提高到了80％。
　　3.2多拷貝HSA融合基因整合與分子伴侶共表達相結合，提高HSA融合蛋白的表達量

10、r>　　在本課題的前期研究中，以pPIC9為表達載體，在野生型或者蛋白酶缺陷型畢赤酵母宿主中實現(xiàn)了多種HSA融合蛋白的分泌表達，包括:HSA/GH、HSA/PTH(1-34)、HSA/IL1 Ra、HSA/Thymosinα1等等。但同時也發(fā)現(xiàn)，這些表達菌株的表達水平普遍較低(25～50mg/L)，通過發(fā)酵條件優(yōu)化對表達量的提升也較為有限。這一方面極大的限制了后期純化蛋白的制備量與制備速度，制約了HSA融合蛋白的臨床前研究進程;另一方面

11、也增加了HSA融合蛋白前期開發(fā)投入以及后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的成本。因此，構建HSA融合蛋白的高表達工程菌株顯得尤為重要。
　　本文考察了HSA融合基因拷貝數(shù)以及幾種重要的分子伴侶共表達對HSA融合蛋白表達量的影響。結果表明，通過兩種方式的結合可以使HSA融合蛋白在野生型畢赤酵母中的表達量大幅度提高，如HSA-G1-GH經(jīng)過優(yōu)化后的表達量在搖瓶水平從低于50mg/L提高到了364mg/L。該方法也可用于蛋白酶缺陷型宿主，如優(yōu)化后的HSA/