1、犬瘟熱(Canine distemper，CD)系由副粘病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性的傳染病。該病的流行與傳播嚴(yán)重地影響了經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖業(yè)、野生動物保護(hù)業(yè)、動物園觀賞業(yè)和養(yǎng)犬業(yè)的持續(xù)發(fā)展。隨著生態(tài)環(huán)境的變化及犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)對流行因素的適應(yīng)，其自然感染宿主范圍在不斷擴(kuò)大，加之CDV變異株的出現(xiàn)，目前犬瘟熱的發(fā)病率和致死率均有所升高，流行趨勢由散在發(fā)生趨勢向群

2、發(fā)趨勢發(fā)展，臨床癥狀也越來越復(fù)雜，其危害也越來越大。特別是國寶大熊貓等珍稀動物及獼猴等靈長類動物的CDV感染，使CDV的致病地位日益突出。最新研究證實(shí)CDV在體外可感染人的前破骨細(xì)胞，在破骨細(xì)胞內(nèi)增殖，表明CDV的自然宿主可能已擴(kuò)展到了人類，犬瘟熱可能是犬傳染給人的第二個病毒性傳染病。 由于CDV呈世界性分布，自然感染宿主種類廣泛，且可在大量的不相關(guān)動物種類間交叉感染。因此，消滅CDV幾乎是不可能的，但可以利用疫苗進(jìn)行主動免疫控

3、制犬瘟熱。目前常用的犬瘟熱疫苗有CDV死毒苗、MV疫苗、CDV弱毒疫苗。但是CDV死苗和MV疫苗不能提供動物持久的保護(hù)力，而CDV弱毒疫苗的穩(wěn)定性較差，接種后易受母源抗體的干擾，對某些免疫缺陷動物和野生動物不安全，具有散毒的危險，所以人們已開始研制新型疫苗，如核酸苗、基因工程亞單位苗、重組病毒苗等控制犬瘟熱。本研究進(jìn)行了以下幾方面的工作，為水貂CD核酸疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 1，水貂犬瘟熱病毒的分離與鑒定從山東省青島市某水貂養(yǎng)殖場

4、疑似犬瘟熱的病死貂的肝臟中分離出1株病毒，并進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定。結(jié)果表明：該毒株接種于Vero傳代細(xì)胞后出現(xiàn)了CDV典型而有規(guī)律的細(xì)胞病變；其理化特性與CDV相同；致細(xì)胞病變作用可被兔抗CDV陽性血清阻斷；包涵體檢查在細(xì)胞漿中可見圓形或橢圓形嗜酸性包涵體；間接免疫熒光試驗(yàn)表明接種病毒的BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)特異性的亮綠色熒光，而正常細(xì)胞則未見綠色熒光；提取接種病料后的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中的總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出了324bp和1

5、053bp的目的片段。證明該毒株為CDV，命名為CDVSJ。 2，犬瘟熱病毒分離株附著蛋白(H)基因的克隆與序列分析對犬瘟熱病毒水貂分離株CDVSJ株的H基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pMD-18T SimpleVector連接，并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，成功地構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-CDVH，并測定其序列。測序結(jié)果表明，CDVSJ株H基因由1596 bp組成，編碼532個氨基酸，含有

6、5個潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，分別在76～78、318～320、349～351、383～385、514～516；含有12個半胱氨酸殘基，分別位于66、81、115、211、223、304、309、317、417、493、502、529位。與01-2689、007Lm、2544Han95、25259、A75-171、 American dog、black leopard，Liud、CDTaichung、Convac、Danish dog、

7、Danishmink、DK91D、Greenlandic dog、Hamatsu、Javelina、KDK-1、LP、Onderstepoort、Snyder Hill、Tanu96、TN、Ueno和Yanaka毒株核苷酸序列同源性分別為90.7％、91.0％、91.9％、92.2％、92.0％、91.2％、91.8％、91.9％、90.9％、96.9％、92.0％、92.4％、92.0％、92.1％、90.9％、91.8％、91.1％

8、、92.5％、96.6％、98.6％、91.1％、91.1％、91.0％和91.0％；推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為89.9％、90.1％、91.4％、90.2％、91.9％、91.4％、91.9％、91.7％、91.2％，95.1％、91.4％、91.9％、91.6％、91.4％、90.4％、91.2％、90.8％、91.4％、94.6％、97.0％、90.8％、90.6％、91.0％和90.8％。與Onderstepoort、Conv

9、ac、Hamatsu、A75/17、TN株相比，根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列比較分析表明，犬瘟熱病毒分離株CDVSJ具有5個潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，與Onderstepoort疫苗株相比，在318Aa～320Aa、383Aa～385Aa處多2個N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)；與疫苗Convac株和野毒A75/17株相比，在530Aa～532Aa處少1個N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)；與Hamatsu株相比，在236Aa～238Aa、511Aa～513Aa和530Aa～53

10、2Aa處少3個N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)；與TN株相比，在236Aa～238Aa和511Aa～513Aa處少2個糖基化位點(diǎn)。聚類分析結(jié)果表明CDVSJ株與SnyderHill毒株的親緣關(guān)系最近，二者與疫苗株Onderstepoort和Convac具有較高的同源性，組成一組，而與標(biāo)準(zhǔn)野毒強(qiáng)毒株Hamatsu的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 3，犬瘟熱病毒分離株融合蛋白(F)基因的克隆與序列分析對犬瘟熱病毒水貂分離株CDVSJ株的F基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增

11、，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pMD-18T SimpleVector連接，并轉(zhuǎn)化至E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，成功地構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-CDVF，并測定其序列。測序結(jié)果表明，CDVSJ株F基因由1053 bp組成，編碼351個氨基酸，含有9個半胱氨酸殘基；與01-2601株、2544-Han95株、5804P株、25259株、A75-17株、DOGDK91C株、ONP株、PDV-2株和98-2646株相比，核苷酸序列同源性

12、分別為95.4％、93.8％、93.9％、94.3％、94.5％、93.9％、97.3％、94.7％和94.1％；推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為97.4％、96.6％、97.7％、98.0％、97.4％、97.4％、97.2％、98.0％和96.6％?？乖笖?shù)比較結(jié)果說明分離株CDVSJ與疫苗Onderstepoort株、強(qiáng)毒A75-17株在40-50位氨基酸間存在較大差異。與Onderstepoort株、A75/17株和PDV-2株相比

13、，各個毒株F蛋白的半胱氨酸殘基數(shù)目及其位置保守，均為9個。這說明CDV F蛋白基因是一個相對保守的結(jié)構(gòu)蛋白基因。 4，犬瘟熱病毒分離株F基因的真核表達(dá)將克隆至pMD-18T simple vector中的F基因片段亞克隆至pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中，成功地構(gòu)建出真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-F和pcDNA3.1-SF。經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)法將真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-F和pcDNA3.1-SF轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞

14、中，通過ELISA法、間接熒光抗體技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測，證實(shí)目的基因在哺乳動物細(xì)胞中獲得了表達(dá)。 5，真核重組表達(dá)質(zhì)粒的免疫研究為研究真核重組表達(dá)質(zhì)粒的免疫特性，將真核重=組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-F和pcDNA3.1-SF肌注日本大耳白兔進(jìn)行免疫，同時設(shè)置pcDNA3.1(+)、生理鹽水陰性對照組和犬瘟熱弱毒疫苗陽性對照組。間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，免疫兔體內(nèi)產(chǎn)生了針對CDV的特異性抗體，且抗體水平隨著免疫次數(shù)和免

15、疫劑量的增加而升高，重組質(zhì)粒組體液免疫水平顯著高于生理鹽水組和空載體組，但不及弱毒疫苗對照組。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果表明，重組質(zhì)粒免疫組產(chǎn)生了細(xì)胞免疫，但低于弱毒疫苗組。 本研究從疑似犬瘟熱病死貂肝臟中分離出1株犬瘟熱病毒，并對水貂源犬瘟熱病毒分離株的F基因和H基因進(jìn)行了克隆與序列分析，豐富了CDV分子生物學(xué)研究內(nèi)容；構(gòu)建的CDV F基因真核重組表達(dá)質(zhì)粒，在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)產(chǎn)生了特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫。為進(jìn)一步研究CDV F和H基