1、背景及目的：
　　 人羊膜組織產(chǎn)后常被丟棄,作為“廢物”利用,是再生醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞治療的良好資源。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似,從羊膜中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞具有很好的免疫耐受性,適用于異體干細(xì)胞移植,也是干細(xì)胞研究的良好對(duì)象。
　　 細(xì)胞遷移在體內(nèi)組織、器官再生和分化過程中非常重要,因此研究人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)如何在適當(dāng)時(shí)間遷移到適當(dāng)部位,在

2、再生醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞治療中非常必要。表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)在多種類型細(xì)胞遷移和增殖中發(fā)揮作用,促進(jìn)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞遷移;創(chuàng)傷組織產(chǎn)生的EGF能明顯促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。另外,EGF價(jià)格低,可以大量生產(chǎn),且在多種情況下都能保持穩(wěn)定,所以我們選擇EGFR信號(hào)通路作為研究對(duì)象。有報(bào)道EGF能促進(jìn)大鼠和永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移,而在hAMSCs增殖和遷移中的作用未見報(bào)道。

3、r>　　 細(xì)胞應(yīng)答外界信號(hào)分子向特定方向遷移是一個(gè)復(fù)雜的過程,需要前端和后部在時(shí)空方向上獲得不對(duì)稱性。盡管調(diào)控MSC遷移的分子研究很多,但對(duì)遷移方向的調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)較少。由于傷口成功修復(fù)需要MSC在確切時(shí)間遷移到確切位置,因此研究干細(xì)胞定向遷移(directional migration)對(duì)于創(chuàng)傷修復(fù)具有重要意義。
　　 小鼠胚胎干細(xì)胞中EGFR.激活可引起下游PI3K/AKT活化,ERK信號(hào)通路是EGFR調(diào)控的另一條通路,與細(xì)

4、胞增殖和遷移有關(guān)。我們將檢測(cè)EGF是否能引起體外培養(yǎng)hAMSCs的定向遷移,探索EGF通過EGFR信號(hào)通路促進(jìn)hAMSCs定向遷移的機(jī)制。體外擴(kuò)增并增強(qiáng)hAMSCs遷移能力能增加體內(nèi)治療干細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞遷移到損傷組織的能力,有助于提高治療效果。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 酶消化法體外分離hAMSCs,制成單細(xì)胞懸液后,以一定細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5、>　　 2、免疫細(xì)胞化學(xué)
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志,進(jìn)行波形蛋白、CD44、CD90、PAK1等染色。
　　 3、檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　 MTT法檢測(cè)EGF對(duì)hAMSCs增殖的作用,及EGFR抑制劑AGl478、P13K抑制劑LY294002、ERK抑制劑U0126對(duì)EGF作用的影響。
　　 4、檢測(cè)細(xì)胞遷移
　　 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度EGF對(duì)hAMSCs遷移的影響;Transwell小

6、室測(cè)定EGF對(duì)hAMSCs遷移的作用,及EGFR抑制劑AG1478、PI3K抑制劑LY294002、ERK抑制劑U0126對(duì)EGF作用的影響;Dunn chamber法觀察EGF濃度梯度對(duì)hAMSCs定向遷移的影響。
　　 5、Western-blot
　　 Western-blot檢測(cè)EGF處理后EGFR、AKT、ERK的磷酸化水平的變化,分析其與細(xì)胞遷移的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)

7、>　　 體外分離的hAMSCs生長(zhǎng)狀況良好,接種六七天融合度達(dá)90%以上,細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀排列.傳至3代后呈均勻梭形。
　　 2、免疫染色
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)分離獲得的目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志波形蛋白、CD90、CD44,不表達(dá)CD14、CD45。
　　 3、檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　 MTT結(jié)果顯示,不同濃度EGF對(duì)hAMSCs增殖起到不同程度的促進(jìn)作用。而EGF對(duì)細(xì)胞增殖的作用被AG1

8、478、LY294002和U0126抑制。
　　 4、檢測(cè)細(xì)胞遷移
　　 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EGF濃度為100ng/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用最明顯。Transwell結(jié)果顯示EGF促進(jìn)hAMSCs遷移,AG1478、LY294002和U0126作用后,遷移細(xì)胞數(shù)與EGF組相比明顯減少。Dunnchamber結(jié)果顯示EGF濃度梯度能引起hAMSCs定向遷移。
　　 5、Western-blot
　　 We

9、stern blot結(jié)果顯示,EGF對(duì)hAMSCs作用過程中存在EGFR和P13K/AKT及ERK1/2的短暫激活。
　　 結(jié)論：
　　 本研究發(fā)現(xiàn),EGF通過激活EGFR其下游的PI3K/AKT和ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)hAMSCs的EGF高濃度方向定向遷移,但EGF啟動(dòng)hAMSCs定向遷移的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。EGF可激活PAK1表達(dá),因此PAK1可能參與hAMSCs的定向遷移。表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)的顯著差異表達(dá)基因