1、研究背景:
　　 硬皮病是一種以皮膚和內(nèi)臟膠原纖維進(jìn)行性硬化為特征的結(jié)締組織病。本病病因尚不清楚，目前主要有免疫學(xué)說、膠原合成學(xué)說和血管學(xué)說等。迄今為止，硬皮病仍無有效的防治措施?；蛑委熥鳛橐婚T新興的學(xué)科，其研究進(jìn)展非常迅速。目前，基因治療在遺傳性疾病、心血管疾病和腫瘤等多種病種中都取得了喜人的成績(jī)，已被批準(zhǔn)的基因治療方案有百例以上。在國(guó)外，脂質(zhì)體介導(dǎo)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human hepatocyte growth facto

2、r，hHGF)基因治療硬皮病已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室初步獲得成功。該研究結(jié)果證實(shí)HGF對(duì)于改善硬皮病的皮膚硬化切實(shí)有效。但是脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，外源治療性基因和宿主細(xì)胞的基因組不發(fā)生整合，只能夠短暫發(fā)揮作用。在人類基因治療的臨床實(shí)施中，只有穩(wěn)定表達(dá)外源治療性基因的細(xì)胞在病人體內(nèi)才能產(chǎn)生治療效果。
　　 如何有效地將外源治療性基因?qū)胧荏w細(xì)胞，是基因治療研究中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。盡管目前已有多種基因載體可供選擇，在人類基因治療的實(shí)施中，一般多選

3、用病毒載體。與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體(1entiviral vectors，LVs)能夠有效地感染并整合到分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞中，外源基因表達(dá)持續(xù)且穩(wěn)定，具有鮮明特色。近些年來，隨著安全性設(shè)計(jì)的發(fā)展，尤其是在HIV-1基礎(chǔ)上改造而成的“自滅活”慢病毒的出現(xiàn)，大大降低了LVs潛在的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，使其在基因治療中的應(yīng)用也逐漸得以擴(kuò)展。在國(guó)外，LVs已被

4、批準(zhǔn)在基因治療某些感染性疾病和遺傳性疾病等的臨床實(shí)施方案中使用。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的原始細(xì)胞。MSCs免疫原性低，能夠向損傷部位遷移，分泌多種生物活性分子或向損傷細(xì)胞分化，發(fā)揮組織再生和修復(fù)等功能。MSCs還可以影響結(jié)締組織中的膠原代謝，產(chǎn)生抗纖維化的效應(yīng)。目前，用MSCs移植嘗試治療肺臟、腎臟和肝臟纖維化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)獲得成功

5、。另外，已有的實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明，MSCs還具有免疫抑制和抗炎效應(yīng)。因此，針對(duì)硬皮病存在自身免疫和以纖維化病變?yōu)橹?，MSCs移植可以成為今后研究硬皮病治療方案的一個(gè)方向。
　　 除外MSCs的以上生物學(xué)特性，MSCs還易于整合外源基因，可以在體外和體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，且不影響其干細(xì)胞特性，使其在基因治療中的應(yīng)用更為廣泛。HGF可以促進(jìn)MSCs向損傷部位遷移，增強(qiáng)組織再生和修復(fù)?；贖GF和MSCs的協(xié)同作用，可以預(yù)期，將穩(wěn)定表

6、達(dá)HGF基因的MSCs回輸硬皮病動(dòng)物模型體內(nèi)將會(huì)發(fā)揮更大的治療效應(yīng)。目前，體內(nèi)和體外研究表明，LVs可以有效地介導(dǎo)MSCs整合外源治療性基因，而且不影響其生物學(xué)特征。因此，在用HGF基因修飾的MSCs移植治療硬皮病的研究方案中，LVs是合適的基因載體。
　　 大量研究表明，骨髓、外周血和脂肪等多種組織中均存在MSCs，以骨髓來源的MSCs研究較成熟。近年來，研究者們?cè)谄つw真皮組織中成功分離MSCs。皮膚是人體最大的器官，且取材方

7、便，出于安全性和倫理學(xué)的考慮，真皮組織是MSCs的又一重要來源途徑。
　　 綜上所述，HGF基因修飾的MSCs移植是硬皮病基因治療研究中一個(gè)可供選擇的新方案。LVs介導(dǎo)hHGF基因在大鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(rat dermis MSCs，rdMSCs)穩(wěn)定表達(dá)的實(shí)驗(yàn)將為硬皮病的基因治療提供基礎(chǔ)。
　　 研究目的:
　　 1.慢病毒載體在體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移效率；
　　 2.慢病毒感染后

8、，人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因在體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)情況；
　　 3.人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)移是否改變體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖特性。
　　 研究方法:
　　 根據(jù)MSCs的黏附特性采用酶消化法分離新生大鼠真皮來源的MSCs，通過細(xì)胞貼壁，傳代培養(yǎng)進(jìn)行篩選。取第3代(P3)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，包括流式細(xì)胞術(shù)分析多種細(xì)胞表面分子(CD34、CD44、CD45和CD90)和油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞體外誘導(dǎo)成脂

9、肪分化的潛能。hHGF-GFP-LVs以不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection,MOI)感染P3細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)，通過GFP熒光陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)估計(jì)慢病毒的基因轉(zhuǎn)移效率，從而確認(rèn)多少的MOI是合適的。在MOI為100的條件下，hHGF-GFP-LVs和NC-GFP-LVs(陰性對(duì)照組)分別感染P3細(xì)胞。慢病毒感染以后，細(xì)胞每4天傳代培養(yǎng)，分別收集兩組P4、P6和P8細(xì)胞的培養(yǎng)上清。將標(biāo)本放于-20℃，密

10、封保存。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的hHGF水平。此外，收集第1、2、3、4、5、6天轉(zhuǎn)染rdMSCs和未被轉(zhuǎn)染rdMSCs(空白對(duì)照組)，利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別繪制兩組細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，從而分析hHGF基因轉(zhuǎn)移是否改變r(jià)dMSCs的增殖特性。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:
　　 1.定量資料選擇算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)描述；
　　 2.重復(fù)測(cè)量定量資料的比較采用方差分析；
　　 3.檢驗(yàn)水

11、準(zhǔn)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外培養(yǎng)rdMSCs是貼壁細(xì)胞，有較強(qiáng)的增殖能力，呈克隆性生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)至第3代，細(xì)胞形態(tài)較均一，以梭形為主；細(xì)胞表面分子流式細(xì)胞儀分析結(jié)果：CD44和CD90陽性細(xì)胞分別占99.3％和99.9％，造血細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34和CD45陽性率僅為1.1％和1.6％；細(xì)胞經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)體系培養(yǎng)14天

12、，部分細(xì)胞的胞漿中可見脂滴，油紅O染色陽性。
　　 2.hHGF-GFP-LVs表達(dá)較慢，感染后72-96小時(shí)，GFP基因表達(dá)才達(dá)到高峰。慢病毒的感染效率與MOI具有量效關(guān)系。提高M(jìn)OI值，可以增加病毒的感染效率。MOI為100時(shí)，LVs的基因轉(zhuǎn)移效率能夠達(dá)80％以上。
　　 3.轉(zhuǎn)染rdMSCs的細(xì)胞上清hHGF水平高于陰性對(duì)照組(F=3229.386.P＜0.05)。hHGF-rdMSCs組P4、P6和P8細(xì)胞的培養(yǎng)

13、上清hHGF水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.轉(zhuǎn)染rdMSCs與空白對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線相似，均呈“S”形，轉(zhuǎn)染rdMSCs仍有較強(qiáng)的增殖能力。
　　 結(jié)論:
　　 1.在體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞中，慢病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率高；
　　 2.慢病毒載體可以介導(dǎo)hHGF基因在體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且不影響細(xì)胞的增殖特